Odhaľte tajomstvá vysokokvalitnej extrakcie plazmidu

Extrakcia plazmidu je pre výskumníkov kľúčová. Ako génové vektory sú plazmidy životne dôležité vo výskume vakcín a génovej terapii, kde na kvalite záleží. Medzi kľúčové kvalitatívne faktory patrí podiel supercoiled a obsah endotoxínov. Predpisy sa líšia: FDA ≥ 80 %, SMPA ≥ 85 %, NMPA ≥ 90 %, s < 5 % lineárnej/otvorenej cirkulárnej DNA. Klienti často uprednostňujú ≥95% supercoiled. Hladiny endotoxínu sú: výskum (>50 EU/ug), transfekcia (<50 EU/ug) a bez endotoxínu (<0.1 EU/ug).

Supercoiled plazmid DNA

Plazmidy z Escherichia coli zahŕňajú supercoiled (SC), open-circulcular (OC) a lineárnu (L) DNA. Vysoký podiel SC zvyšuje účinnosť transfekcie a expresiu. Napríklad transfekcia 85.45% SC plazmidu je 2.5x vyššia a expresia HGF 93.28% SC plazmidu je 1.8x vyššia, čo potvrdzuje nadradenosť SC DNA.

DNA s otvoreným kruhom: Keď sa zlomí jedno vlákno dvojvláknovej DNA, nadzávitnicová štruktúra sa uvoľní a vytvorí sa otvorený kruhový plazmid s väčším objemom, ktorý počas elektroforézy migruje najpomalšie a je umiestnený navrchu.

Lineárna DNA: Keď sa obe vlákna plazmidovej DNA zlomia, vytvorí sa lineárna štruktúra s relatívne menším objemom, ktorá migruje rýchlejšie ako DNA s otvoreným kruhom, ale pomalšie ako superšpirálová DNA, umiestnená na druhom mieste.

Supercoiled DNA: Dve špirály sa prepletajú, skrúcajú sa do superšpirálovej štruktúry založenej na špirále DNA. Má najmenší objem a najrýchlejšie migruje počas elektroforézy, je umiestnený na dne.

Kvantitatívna analýza pomeru supercoiled

Laboratóriá používajú elektroforézu na agarózovom géli (AGE) a analyzátor Gel-Pro na posúdenie nadzávitnicových pomerov pomocou elektroforéznych obrázkov. Jeden obrázok ukazuje 97.539 % SC DNA, zatiaľ čo ďalší ukazuje 63.833 % SC a 36.167 % OC DNA (lineárna DNA nie je viditeľná).

Tajomstvo endotoxínu v plazmidoch

Endotoxín je zložka vonkajšej vrstvy bunkovej steny gramnegatívnych baktérií, uvoľnená po bakteriálnej smrti alebo lýze, obsahujúca toxický lipopolysacharid A. Počas extrakcie plazmidu endotoxín vstupuje do lyzačného roztoku, čo ovplyvňuje účinnosť transfekcie a spúšťa nešpecifické imunitné reakcie, čo vedie k falošne pozitívnym výsledkom v experimentoch.

Kvantitatívna a kvalitatívna analýza endotoxínu

Test Limulus amebocyte lysate (LAL) deteguje endotoxín prostredníctvom aglutinácie s kyselinou 2-keto-3-deoxyoktónovou (KDO) v lipopolysacharide (LPS). Je kvalitatívny a semikvantitatívny, čo naznačuje prítomnosť endotoxínu prostredníctvom koagulácie alebo zmeny farby pri zmiešaní so vzorkami.

Yaohai Bio-Pharma ponúka superšpirálové plazmidy bez endotoxínov. Outsourcing spoločnosti Yaohai zvyšuje účinnosť transfekcie a expresie. Dodávané plazmidy majú ≥ 95 % SC podiel (priemer 85 % ± 10 %) a hladiny endotoxínu ≤ 0.1, ≤ 0.01 alebo ≤ 0.005 EU/μg.

Aktívne tiež hľadáme inštitucionálnych alebo individuálnych globálnych partnerov. Ponúkame najkonkurencieschopnejšiu kompenzáciu v odvetví. Ak máte akékoľvek otázky, neváhajte nás kontaktovať: [email protected]