Μέθοδοι για τη βελτίωση της απόδοσης του pDNA

Η παραγωγή του πλασμιδικού DNA (pDNA) βασίζεται στον γενετικό ανασυνδυασμό, ο οποίος περιλαμβάνει τη σύνδεση του γονιδίου στόχου και άλλων στοιχείων για να σχηματιστεί μια ομοιοπολικά κλειστή κυκλική δομή. Ζύμωση υψηλής κυτταρικής πυκνότητας του Escherichia coli και ο καθαρισμός είναι οι κύριοι τρόποι παραγωγής pDNA.

Η ανάπτυξη της κυτταρικής και γονιδιακής θεραπείας (CGT) και του mRNA έχει φέρει περισσότερες δυνατότητες για την πρόληψη επιδημικών ασθενειών και τη θεραπεία σπάνιων ασθενειών. Η βιομηχανική παραγωγή CGT και mRNA απαιτεί υψηλής ποιότητας pDNA. Επομένως, βελτιστοποιημένη ζύμωση του Ε. coli και υψηλή απόδοση pDNA είναι ζωτικής σημασίας για τη σχέση κόστους-αποτελεσματικότητας των εμβολίων/φαρμάκων CGT και mRNA.

1. Αύξηση της ζήτησης για pDNA

Σύμφωνα με την Έκθεση Αγοράς Παραγωγής Plasmid DNA των ΗΠΑ, η αγορά CGT αναμένεται να αυξηθεί από 7.2 δισεκατομμύρια δολάρια ΗΠΑ το 2023 σε 23.3 δισεκατομμύρια δολάρια ΗΠΑ το 2028. Επιπλέον, η γονιδιακή θεραπεία θα γίνει η κυρίαρχη κατεύθυνση της CGT. Ένας αυξανόμενος αριθμός θεραπειών CGT εγκρίνεται για κυκλοφορία στην αγορά και περισσότεροι αγωγοί εισέρχονται στην κλινική φάση. Ως αποτέλεσμα, η ζήτηση για pDNA αυξάνεται στα ύψη.

Εκτός από τις θεραπείες CGT, το pDNA είναι μια απαραίτητη πρώτη ύλη για την παραγωγή εμβολίων mRNA. Με τη συνεχή καινοτομία της τεχνολογίας mRNA στους τομείς των εμβολίων μολυσματικών ασθενειών, των εμβολίων κατά του καρκίνου και των θεραπειών σπάνιων ασθενειών, η ζήτηση για pDNA θα αυξηθεί επίσης γρήγορα.

2. Μέθοδοι για τη βελτίωση της απόδοσης του pDNA

Με την αυξανόμενη ζήτηση για πλασμιδικό DNA, η τρέχουσα τεχνολογική ανάπτυξη επικεντρώνεται στη βελτιστοποίηση των στρατηγικών ζύμωσης για τη βελτίωση της απόδοσης του pDNA. Οι βασικές προϋποθέσεις για την ανάπτυξη της διαδικασίας ανάντη περιλαμβάνουν συστατικά του μέσου καλλιέργειας, τη θερμοκρασία, το pH, το διαλυμένο οξυγόνο (DO), τον ειδικό ρυθμό παραγωγής και τις στρατηγικές τροφοδοσίας-παρτίδας.

Μέσο καλλιέργειας: Το μέσο καλλιέργειας για τη ζύμωση του Ε. coli που χρησιμοποιείται στην παραγωγή πλασμιδίου είναι τυπικά ένα ημι-συνθετικό μέσο. Αποτελείται από πηγές άνθρακα, πηγές αζώτου, ανόργανα άλατα και ιχνοστοιχεία. Μεταξύ αυτών, οι τύποι πηγών άνθρακα και αζώτου είναι ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη του Ε. coli και τη συσσώρευση προϊόντων. Οι κοινώς χρησιμοποιούμενες πηγές άνθρακα είναι η γλυκόζη και η γλυκερίνη και οι πηγές αζώτου περιλαμβάνουν οργανικές και ανόργανες πηγές αζώτου. Επιπλέον, μια υπερβολικά υψηλή αναλογία άνθρακα προς άζωτο (C/N) μπορεί να επιβραδύνει την ανάπτυξη του βακτηριακού στελέχους, ενώ μια υπερβολικά χαμηλή αναλογία C/N μπορεί να προάγει την ταχεία ανάπτυξη αλλά να περιορίζει τη συσσώρευση προϊόντος.

Θερμοκρασία: Η βέλτιστη θερμοκρασία για την ανάπτυξη του Ε. coli είναι 37°C. Ωστόσο, χαμηλότερες θερμοκρασίες (30-37°C) μπορούν να χρησιμοποιηθούν στη ζύμωση κατά παρτίδες για να μειωθεί ο μέγιστος ειδικός ρυθμός παραγωγής, αυξάνοντας έτσι την αντιγραφή του πλασμιδίου. Για ευαίσθητα στη θερμότητα πλασμίδια, η αύξηση της θερμοκρασίας στους 42°C μπορεί να προκαλέσει διπλασιασμό του αριθμού αντιγράφων του πλασμιδίου.

pH: Το βέλτιστο pH για την ανάπτυξη του Ε. coli είναι 7±0.2. Το pH του ζωμού ζύμωσης συνήθως διατηρείται μέσω αντλιών οξέος-βάσης.

DO: Το κρίσιμο εύρος συγκέντρωσης διαλυμένου οξυγόνου για Ε. coli είναι 20%-30%. Ανεπαρκές διαλυμένο οξυγόνο μπορεί να οδηγήσει σε υπερβολική παραγωγή οξικού οξέος, επηρεάζοντας την ανάπτυξη των βακτηρίων και ακόμη και προκαλώντας βακτηριακή αυτόλυση. Το υπερβολικό διαλυμένο οξυγόνο μπορεί να προκαλέσει δηλητηρίαση από οξυγόνο. Οι παράγοντες που επηρεάζουν το διαλυμένο οξυγόνο περιλαμβάνουν την ταχύτητα ανάδευσης, τον ρυθμό αερισμού κ.λπ.

Στρατηγική Fed-batch: Συχνά επιλέγεται ζύμωση τροφοδοσίας παρτίδας για παραγωγή πλασμιδίου. Πρώτον, είναι ευνοϊκό για την επίτευξη ζύμωσης υψηλής κυτταρικής πυκνότητας Ε. Coli, με αποτέλεσμα περισσότερη βιομάζα, η οποία χρησιμεύει ως βάση για υψηλή απόδοση. Δεύτερον, η υπερβολικά γρήγορη ανάπτυξη της Escherichia coli επηρεάζει τη σταθερότητα του πλασμιδίου. Η προσθήκη περιοριστικών θρεπτικών συστατικών με τη χρήση παρτίδας τροφοδοσίας μπορεί να ελέγξει ορθολογικά τον ρυθμό ανάπτυξης του Ε. coli, ενισχύοντας έτσι την απόδοση πλασμιδίου. Η στρατηγική ελέγχου DO-stat χρησιμοποιείται συνήθως για τη ρύθμιση της παρτίδας τροφοδοσίας κατά τη διάρκεια της πλασμιδικής ζύμωσης. Υπάρχει επίσης έρευνα που δείχνει τη σκοπιμότητα της στρατηγικής pH-stat.

3. Υπηρεσίες που παρέχονται από την Yaohai Bio-Pharma

Η Yaohai Bio-Pharma έχει αναπτύξει μια ώριμη πλατφόρμα για την παραγωγή πλασμιδίων. Επιπλέον, η Yaohai Bio-Pharma βελτιστοποίησε το βασικό μέσο καλλιέργειας, το μέσο τροφοδοσίας και τη στρατηγική ελέγχου της ζύμωσης. Μέσα σε έναν κύκλο καλλιέργειας 30 ωρών, η απόδοση πλασμιδίου υπερβαίνει το 1 g/L.

Επιπλέον, η Yaohai Bio-Pharma είναι σε θέση να παρέχει λύσεις βελτιστοποίησης διεργασιών που βασίζονται σε μεθόδους ενός παράγοντα ή Σχεδιασμού Πειραμάτων (DoE) για διαφορετικά πλασμίδια και βακτήρια-ξενιστές. Η Yaohai Bio-Pharma στοχεύει να καλύψει τις απαιτήσεις των πελατών για υψηλή απόδοση και ποιότητα πλασμιδίου.

Η Yaohai Bio-Pharma αναζητά επίσης ενεργά θεσμικούς ή μεμονωμένους παγκόσμιους εταίρους και προσφέρει την πιο ανταγωνιστική αποζημίωση στον κλάδο. Εάν έχετε οποιεσδήποτε ερωτήσεις, μη διστάσετε να επικοινωνήσετε: [email protected]