Εκμετάλλευση της Δύναμης της Στρατηγικής Φερμεντασιόν Fed-batch

Η Pichia pastoris χρησιμοποιείται ευρέως στην παραγωγή διάφορων ξενότυπων πρωτεϊνών. Η τεχνολογία Υψηλής Πυκνότητας Φθοράς (HCDF), που εφαρμόζεται μέσω τροφιμοδότησης Fed-Batch, έχει καταφέρει να επιτύχει μεγάλη κλίμακα παραγωγής βιοφαρμακευτικών και βιοποινάμενων ζυμωτικών. Σε ακριβώς ελεγχόμενα μέσα, η χρήση της τεχνολογίας HCDF μπορεί να παράγει υψηλής απόδοσης, υψηλής δραστηριότητας και οικονομικά προσβάσιμες αναδρομικές πρωτεΐνες.

Πρόσφατες έρευνες δείχνουν ότι μέσω των στρατηγικών HCDF γίνονται προσπάθειες για να αυξηθεί η παραγωγή και η δραστηριότητα των ξενότυπων πρωτεϊνών στην Pichia pastoris. Η τεχνολογία HCDF επιτρέπει την εύκολη επίτευξη υψηλών συστάδων κυττάρων σε ορισμένα μέσα, επιτρέποντας έτσι την εξαγωγή πλούσιων αναδρομικών πρωτεϊνών με αυξημένη δραστηριότητα και μειωμένα κόστη μέσω της HCDF. Ωστόσο, η επιλογή της κατάλληλης στρατηγικής HCDF για την επιοπτική αύξηση της υψηλής έκφρασης συγκεκριμένων πρωτεϊνών στην Pichia pastoris παραμένει μια πρόκληση.

Υψηλής Πυκνότητας Φθοράς (HCDF)

Η Pichia pastoris ανήκει στα καλύτερα στην παραγωγή ξένων πρωτεϊνών, και είναι επιλεγμένη για το HCDF σε αυτοματοποιημένα βιορεάκτορες. Το HCDF διαθέτει 3 φάσεις: μπατς με γλυκερόλη, τροφιμοδόσια και επαναγωγή με μεθανόλη. Η Yaohai Bio-Pharma καυχάται με περισσότερα από ένα δεκαετία εμπειρίας στη μικροβιακή ζύμωση και έχει υπηρετήσει πάνω από 400 έργα. Η εταιρεία διαθέτει εκτεταμένη εμπειρία και καλά αναπτυγμένη τεχνολογία, που της επιτρέπει να χρησιμοποιεί διάφορες στρατηγικές HCDF για να βελτιώσει την αποδοτικότητα της παραγωγής πρωτεΐνων.

Ο μεθανόλης λειτουργεί ως καταστιγματικός του AOX1 και ως πηγή άνθρακα, αλλά η συγκέντρωσή του πρέπει να ελέγχεται για να αποφευχθεί η δηλητηριότητα. Η αξιολόγηση διαφορετικών στρατηγικών τροφιμοδόσιας με μεθανόλη είναι κρίσιμη για τη βελτίωση της ανάπτυξης της Pichia pastoris και της έκφρασης πρωτεΐνων.

Στρατηγική επαναγωγής με μεθανόλη

Στην στρατηγική επιβολής μεθανόλης με HCDF σε κύκλο fed-batch, οι βασικές στρατηγικές επιβολής περιλαμβάνουν ένα σύνολο μεθόδων ελέγχου που ρυθμίζουν την προστατευτική προσθήκη μεθανόλης μέσω ελέγχου online/offline ή forward/reverse. Μεταξύ των στατιστικών στρατηγικών επιβολής, οι κύριες περιλαμβάνουν το μ-stat, το Dissolved Oxygen (DO)-stat, το methanol-stat και το biomass-stat.

1.1 μ-stat

η στρατηγική μ-stat διατηρεί σταθερή τη βιομάζα ελέγχοντας το μ, βοηθώντας στην αναπαραγωγικότητα και στη μελέτη της επιρροής του μ στην έκφραση πρωτεΐνης. Ωστόσο, έχει έλλειψη άμεσης ελέγχου μεθανόλης και DO, με κίνδυνο συσσώρευσης και παραγωγής ROS.

1.2 DO-stat

Η στρατηγική DO-stat ρυθμίζει έμμεσα την παροχή μεθανόλης ελέγχοντας το διαλύμενο οξυγόνο για να διατηρήσει την οξυγονοποίηση, αλλά δεν καθορίζει την συγκέντρωση μεθανόλης και την ρυθμία αύξησης, που μπορούν να επηρεάσουν τη μελέτη της έκφρασης πρωτεΐνων. Η οξυγονοποίηση αποτελεί μια πρόκληση στην αεριούχη φθορά, και ενώ η προσθήκη καθαρού οξυγόνου μπορεί να είναι δαπανηρή και δηλητηριώδης, η ενίσχυση της πίεσης είναι μια πιο οικονομική προσέγγιση που μπορεί επίσης να ενισχύσει την δραστηριότητα των πρωτεϊνών.

1.3 Methanol-stat

Η ανεπαρκής ελεγχώμενη συγκέντρωση μεθανόλης τοποθετεί περιορισμούς στις στρατηγικές με μετριασμό με βάση τη μεθανόλη (μ-stat) και DO-stat. Οι στατιστικές στρατηγικές μεθανόλης, που λειτουργούν σε καθεστώς on/off, είναι ευάλωτες σε ανακλονισμούς και έχουν έλλειψη ακρίβειας. Σε αντίθεση, οι διακοπτές PID προσφέρουν μια πιο ακριβή ρύθμιση της συγκέντρωσης μεθανόλης, ενισχύοντας την συνολική αποτελεσματικότητα της φθοράς.

1.4 Biomass-stat

Η στρατηγική biomass-stat ορίζει τη σχέση μεταξύ βιομάζας και διατροφής από μεθανόλη, βελτιώνοντας την ταχύτητα διατροφής μεθανόλης για να αυξηθεί η απόδοση πρωτεΐνων. Η παρακολούθηση της βιομάζας σε πραγματικό χρόνο είναι πιο πρακτική, με τη ροηδιακτινή κυτταρομέτρηση να είναι η προτιμώμενη μέθοδος. Σε κλίμακα 1000L, η βελτιστοποίηση της ταχύτητας διατροφής μεθανόλης βελτιώνει σημαντικά την ενεργειακή δραστηριότητα, την απόδοση και την παραγωγικότητα, υπερβαίνοντας την φερμεντασία σε φλιό.

Στρατηγική συνδιατροφίας

Το γλυκόλυο, ως εμποδιστής του προωθητή AOX1, πρέπει να καταναλωθεί πλήρως πριν από την επανάληψη με μεθανόλη για να μην παρεμποδίσει την παραγωγή πρωτεΐνων. Τα συν-υποστρώματα μπορεί να ενισχύσουν την ενεργειακή δραστηριότητα, αλλά η υπερβολική παρουσία γλυκολύου μπορεί να βλάψει την ανάπτυξη και την έκφραση. Το σορβίτο, το ασκορβινικό οξύ, το μαννίτο και άλλα μπορούν να αντικαταστήσουν το γλυκόλυο, μειώνοντας την πρωτεολύση και τον χρόνο καλλιέργειας και ενισχύοντας την έκφραση πρωτεΐνων.

Το τραπεζικό αρχείο απαιτεί να υιοθετηθούν κατάλληλες μέθοδοι διατήρησης και να τοποθετηθεί σε έντονο περιβάλλον για να διατηρηθεί η σταθερότητα των χαρακτηριστικών του φυλά. Το Yaohai Bio-Pharma μπορεί να καλύψει τις ανάγκες για διατήρηση με γλυκέρινη (μέσω κρύος καταπάκετων ψυγειών ή υγρού αζώτου) και διατήρηση φθίνουσας φύσης για μάια και E. coli.

Οριακή στρατηγική

Στο Pichia pastoris, οι περιοριστικές συνθήκες όπως χαμηλό DO, συγκέντρωση μεθανόλης και περιορισμένο εξυπνευστικό αέριο ενισχύουν την έκφραση ανασυντεταγμένων πρωτεϊνών. Οι συνθήκες με περιορισμένο οξυγόνο ενεργοποιούν τον προωθητή AOX1 μέσω της αύξησης της μεθανόλης, αυξάνοντας την παραγωγή πρωτεΐνων και μειώνοντας τη θερμότητα. Η επαγωγή με χαμηλή θερμοκρασία ενισχύει την απόδοση, την δραστηριότητα, τη σταθερότητα και τη ζωντανότητα των κυττάρων, αλλά προσθέτει κόστος ψύξης. Η pH και ο περιορισμός του αζώτου βοηθούν επίσης στην έκφραση, απαιτώντας προσοχή για να αποφευχθούν λειτουργικά προβλήματα. Ο περιορισμός του αζώτου ενισχύει σημαντικά την συγκεκριμένη παραγωγικότητα πρωτεΐνων.

Το Yaohai Bio-Pharma αναζητά ενεργά παγκόσμιους εταίρους, θεσμικούς ή ιδιώτες, και προσφέρει την πιο ανταγωνιστική αποδοχή στη βιομηχανία. Εάν έχετε οποιαδήποτε ερώτηση, μην διστάσετε να μας επικοινωνήσετε: [email protected]