Αξιοποιώντας τη δύναμη της στρατηγικής ζύμωσης παρτίδας της Fed Ελλάδα

Το Pichia pastoris χρησιμοποιείται ευρέως στην παραγωγή διαφόρων ετερόλογων πρωτεϊνών. Η τεχνολογία High-Cell-Density Fermentation (HCDF), που εφαρμόζεται μέσω της τροφοδοσίας Fed-Batch, έχει επιτύχει με επιτυχία μεγάλης κλίμακας παραγωγή βιοφαρμακευτικών και βιομηχανικών ενζύμων. Σε επακριβώς ελεγχόμενα μέσα, η χρήση της τεχνολογίας HCDF μπορεί να αποκτήσει ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες υψηλής απόδοσης, υψηλής δραστικότητας και οικονομικά αποδοτικές.

Πρόσφατη έρευνα δείχνει ότι μέσω των στρατηγικών HCDF, γίνονται προσπάθειες για την αύξηση της παραγωγής και της δραστηριότητας των ετερόλογων πρωτεϊνών στο Pichia pastoris. Η τεχνολογία HCDF επιτρέπει την αβίαστη επίτευξη συστάδων κυττάρων υψηλού επιπέδου σε καθορισμένα μέσα, επιτρέποντας έτσι την απόκτηση άφθονων ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών με ενισχυμένη δραστηριότητα και μειωμένο κόστος μέσω του HCDF. Ωστόσο, η επιλογή της κατάλληλης στρατηγικής HCDF για τη βελτιστοποίηση της υψηλού επιπέδου έκφρασης συγκεκριμένων πρωτεϊνών στο Pichia pastoris παραμένει μια πρόκληση.

Ζύμωση υψηλής κυτταρικής πυκνότητας (HCDF)

Η Pichia pastoris υπερέχει στην παραγωγή ετερόλογων πρωτεϊνών, που ευνοείται για το HCDF σε αυτοματοποιημένους βιοαντιδραστήρες. Το HCDF έχει 3 στάδια: παρτίδα γλυκερίνης, τροφοδοσία και επαγωγή μεθανόλης. Η Yaohai Bio-Pharma μπορεί να υπερηφανεύεται για πάνω από μια δεκαετία εμπειρίας στη μικροβιακή ζύμωση και έχει εξυπηρετήσει πάνω από 400 έργα. Η εταιρεία διαθέτει εκτεταμένη τεχνογνωσία και καλά ανεπτυγμένη τεχνολογία, που της επιτρέπουν να χρησιμοποιεί διάφορες στρατηγικές HCDF για τη βελτίωση της αποτελεσματικότητας της παραγωγής πρωτεϊνών.

Η μεθανόλη χρησιμεύει και ως επαγωγέας του AOX1 και ως πηγή άνθρακα, αλλά η συγκέντρωσή της πρέπει να ελέγχεται για να αποφευχθεί η τοξικότητα. Η αξιολόγηση διαφορετικών στρατηγικών διατροφής με μεθανόλη είναι ζωτικής σημασίας για τη βελτιστοποίηση της ανάπτυξης του Pichia pastoris και της έκφρασης πρωτεΐνης

Στρατηγική επαγωγής μεθανόλης

Στη στρατηγική επαγωγής μεθανόλης HCDF τροφοδοτούμενης παρτίδας, οι στρατηγικές επαγωγής που βασίζονται στην κατάσταση περιλαμβάνουν ένα σύνολο μεθοδολογιών ελέγχου που ρυθμίζουν τη συμπληρωματική προσθήκη μεθανόλης μέσω διαδικτυακού/εκτός σύνδεσης ή εμπρός/αντίστροφου ελέγχου. Μεταξύ των στατιστικών στρατηγικών επαγωγής, οι κύριες περιλαμβάνουν μ-stat, διαλυμένο οξυγόνο (DO)-stat, μεθανόλη-stat και βιομάζα-stat.

1.1 μ-στατ

Η στρατηγική μ-stat διατηρεί τη βιομάζα σταθερή ελέγχοντας το μ, βοηθώντας την αναπαραγωγιμότητα και μελετώντας την επίδραση του μ στην έκφραση της πρωτεΐνης. Ωστόσο, στερείται άμεσου ελέγχου μεθανόλης και DO, με κίνδυνο συσσώρευσης και παραγωγής ROS.

1.2 DO-stat

Η στρατηγική DO-stat ρυθμίζει έμμεσα την τροφοδοσία μεθανόλης ελέγχοντας το διαλυμένο οξυγόνο για τη διατήρηση της οξυγόνωσης, αλλά δεν καθορίζει τη συγκέντρωση μεθανόλης και τον ρυθμό ανάπτυξης, κάτι που μπορεί να επηρεάσει τη μελέτη της έκφρασης πρωτεΐνης. Η οξυγόνωση αποτελεί πρόκληση στην αερόβια ζύμωση και ενώ η συμπλήρωση καθαρού οξυγόνου μπορεί να είναι δαπανηρή και τοξική, η ενίσχυση της πίεσης είναι μια πιο οικονομική προσέγγιση που μπορεί επίσης να ενισχύσει τη δραστηριότητα των πρωτεϊνών.

1.3 Μεθανόλη-στατ

Ο ανεπαρκής έλεγχος της συγκέντρωσης της μεθανόλης θέτει περιορισμούς τόσο στις στρατηγικές μ-stat όσο και στις στρατηγικές DO-stat. Οι στατιστικές στρατηγικές μεθανόλης, οι οποίες λειτουργούν σε λειτουργία on/off, είναι επιρρεπείς σε διακυμάνσεις και δεν έχουν ακρίβεια. Αντίθετα, οι ελεγκτές PID προσφέρουν πιο ακριβή ρύθμιση της συγκέντρωσης της μεθανόλης, ενισχύοντας τη συνολική αποτελεσματικότητα της ζύμωσης.

1.4 Βιομάζα-στατ

Η στρατηγική βιομάζας-stat καθορίζει τη σχέση μεταξύ βιομάζας και τροφοδοσίας μεθανόλης, βελτιστοποιώντας τον ρυθμό τροφοδοσίας μεθανόλης για την ενίσχυση της απόδοσης πρωτεΐνης. Η διαδικτυακή παρακολούθηση της βιομάζας είναι πιο πρακτική, με την κυτταρομετρία ροής να είναι η προτιμώμενη μέθοδος. Σε κλίμακα 1000L, η βελτιστοποίηση του ρυθμού τροφοδοσίας μεθανόλης βελτιώνει σημαντικά τη δραστηριότητα, την απόδοση και την παραγωγικότητα των ενζύμων, υπερβαίνοντας τη ζύμωση σε φιάλη.

Στρατηγική συντροφοδότησης

Η γλυκερόλη, ως αναστολέας του προαγωγέα AOX1, πρέπει να καταναλώνεται πλήρως πριν από την επαγωγή μεθανόλης για να αποφευχθεί η καταστολή της παραγωγής πρωτεΐνης. Τα συν-υποστρώματα μπορεί να ενισχύσουν την ενζυμική δραστηριότητα, αλλά η περίσσεια γλυκερίνης μπορεί να βλάψει την ανάπτυξη και την έκφραση. Η σορβιτόλη, το ασκορβικό οξύ, η μαννιτόλη και άλλα μπορούν να υποκαταστήσουν τη γλυκερόλη, μειώνοντας τον χρόνο πρωτεόλυσης και καλλιέργειας και ενισχύοντας την έκφραση πρωτεΐνης.

Η τράπεζα στελεχών απαιτεί την υιοθέτηση κατάλληλων μεθόδων συντήρησης και τοποθέτησης σε κατάλληλο περιβάλλον για τη διατήρηση της σταθερότητας των χαρακτηριστικών της παραμόρφωσης. Η Yaohai Bio-Pharma μπορεί να εκπληρώσει τις απαιτήσεις για διατήρηση αποθέματος γλυκερίνης (μέσω καταψύκτη εξαιρετικά χαμηλής θερμοκρασίας ή υγρού αζώτου) και συντήρηση λυοφιλοποιημένης μαγιάς και E. coli.

Στρατηγική που προκαλείται από περιορισμούς

Στο Pichia pastoris, περιοριστικές συνθήκες όπως χαμηλή DO, συγκέντρωση μεθανόλης και όρια οξυγόνου ενισχύουν την έκφραση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης. Οι συνθήκες περιορισμένου οξυγόνου ενεργοποιούν τον προαγωγέα AOX1 μέσω της συσσώρευσης μεθανόλης, αυξάνοντας την παραγωγή πρωτεΐνης ενώ μειώνεται η θερμότητα. Η επαγωγή σε χαμηλή θερμοκρασία ενισχύει την απόδοση, τη δραστηριότητα, τη σταθερότητα και τη βιωσιμότητα των κυττάρων, αλλά προσθέτει κόστος ψύξης. Ο περιορισμός του pH και του αζώτου βοηθούν επίσης την έκφραση, απαιτώντας προσοχή για την αποφυγή λειτουργικών προβλημάτων. Ο περιορισμός του αζώτου ενισχύει σημαντικά την παραγωγικότητα της ειδικής πρωτεΐνης.

Η Yaohai Bio-Pharma αναζητά επίσης ενεργά θεσμικούς ή μεμονωμένους παγκόσμιους εταίρους και προσφέρει την πιο ανταγωνιστική αποζημίωση στον κλάδο. Εάν έχετε οποιεσδήποτε ερωτήσεις, μη διστάσετε να επικοινωνήσετε μαζί μας: [email protected]