Выкарыстанне магутнасці стратэгіі перыядычнай ферментацыі Беларусь

Pichia pastoris шырока выкарыстоўваецца ў вытворчасці розных гетэралагічных бялкоў. Тэхналогія закісання з высокай шчыльнасцю клетак (HCDF), рэалізаваная з дапамогай перыядычнага кармлення, дасягнула поспеху ў буйнамаштабнай вытворчасці біяфармацэўтычных прэпаратаў і прамысловых ферментаў. У дакладна кантраляваных асяроддзях выкарыстанне тэхналогіі HCDF можа атрымаць высокапрадукцыйныя, высокаактыўныя і эканамічна эфектыўныя рэкамбінантныя вавёркі.

Апошнія даследаванні паказваюць, што з дапамогай стратэгій HCDF робяцца намаганні для павелічэння вытворчасці і актыўнасці гетэралагічных бялкоў у Pichia pastoris. Тэхналогія HCDF дазваляе без асаблівых высілкаў ствараць клеткавыя кластары высокага ўзроўню ў пэўных асяроддзях, дазваляючы тым самым атрымліваць вялікую колькасць рэкамбінантных бялкоў з падвышанай актыўнасцю і зніжанымі выдаткамі праз HCDF. Аднак выбар адпаведнай стратэгіі HCDF для аптымізацыі высокага ўзроўню экспрэсіі спецыфічных бялкоў у Pichia pastoris застаецца складанай задачай.

Ферментацыя з высокай шчыльнасцю клетак (HCDF)

Pichia pastoris вылучаецца гетэралагічным вытворчасцю бялку, упадабанага для HCDF у аўтаматычных біярэактарах. HCDF мае 3 стадыі: партыя гліцэрыны, кармленне і індукцыя метанолу. Кампанія Yaohai Bio-Pharma можа пахваліцца больш чым дзесяцігадовым вопытам у галіне мікробнай ферментацыі і абслугоўвала больш за 400 праектаў. Кампанія валодае шырокім вопытам і добра развітой тэхналогіяй, што дазваляе ёй выкарыстоўваць розныя стратэгіі HCDF для павышэння эфектыўнасці вытворчасці бялку.

Метанол адначасова з'яўляецца індуктарам AOX1 і крыніцай вугляроду, але яго канцэнтрацыя павінна кантралявацца, каб прадухіліць таксічнасць. Ацэнка розных стратэгій кармлення метанолам мае вырашальнае значэнне для аптымізацыі росту Pichia pastoris і экспрэсіі бялку

Стратэгія індукцыі метанолу

У стратэгіі індукцыі метанолу HCDF з перыядычнай падкормкай, стратэгіі індукцыі на аснове стану ахопліваюць набор метадалогій кантролю, якія рэгулююць дадатковае даданне метанолу з дапамогай онлайн/афлайн або прамога/зваротнага кіравання. Сярод стратэгій статыстычнай індукцыі асноўныя з іх ўключаюць μ-stat, раствораны кісларод (DO)-stat, метанол-stat і біямасу-stat.

1.1 мк-стат

Стратэгія μ-stat падтрымлівае стабільнасць біямасы, кантралюючы μ, дапамагаючы ўзнаўляльнасці і вывучаючы ўплыў μ на экспрэсію бялку. Аднак яму не хапае прамога кантролю метанолу і DO, што пагражае назапашваннем і генерацыяй АФК.

1.2 DO-стат

Стратэгія DO-stat ўскосна рэгулюе падачу метанолу, кантралюючы раствораны кісларод для падтрымання аксігенацыі, але яна не фіксуе канцэнтрацыю метанолу і хуткасць росту, што можа паўплываць на даследаванне экспрэсіі бялку. Насычэнне кіслародам стварае праблему пры аэробнай ферментацыі, і хаця дабаўка чыстага кіслароду можа быць дарагой і таксічнай, павышэнне ціску з'яўляецца больш эканамічным падыходам, які можа таксама павялічыць актыўнасць бялку.

1.3 Метанол-стат

Неадэкватны кантроль канцэнтрацыі метанолу стварае абмежаванні як для стратэгій μ-stat, так і для DO-stat. Статыстычныя стратэгіі метанолу, якія працуюць у рэжыме ўключэння/выключэння, схільныя да ваганняў і не маюць дакладнасці. Наадварот, ПІД-рэгулятары забяспечваюць больш дакладнае рэгуляванне канцэнтрацыі метанолу, павышаючы агульную эфектыўнасць закісання.

1.4 Статыстыка біямасы

Стратэгія статыстыкі біямасы вызначае ўзаемасувязь паміж падачай біямасы і метанолу, аптымізуючы хуткасць падачы метанолу для павышэння выхаду бялку. Інтэрнэт-маніторынг біямасы з'яўляецца больш практычным, з праточнай цытаметрыяй з'яўляецца пераважным метадам. У маштабе 1000 л аптымізацыя хуткасці падачы метанолу значна паляпшае актыўнасць ферментаў, ураджайнасць і прадукцыйнасць, пераўзыходзячы ферментацыю ў колбе.

Стратэгія сумеснага кармлення

Гліцэрына, як інгібітар прамотара AOX1, павінен быць цалкам спажыты перад індукцыяй метанолу, каб пазбегнуць падаўлення вытворчасці бялку. Субстраты могуць павысіць актыўнасць ферментаў, але лішак гліцэрыны можа пашкодзіць росту і экспрэсіі. Сарбіт, аскарбінавая кіслата, манніт і іншыя могуць замяніць гліцэрына, скарачаючы пратэаліз і час культывавання і ўзмацняючы экспрэсію бялку.

Банк штамаў патрабуе прыняцця адпаведных метадаў захавання і размяшчэння ў адпаведных умовах для падтрымання стабільнасці характарыстык штамаў. Yaohai Bio-Pharma можа выканаць патрабаванні па захаванні запасаў гліцэрыны (праз маразільныя камеры пры звышнізкай тэмпературы або вадкім азотам) і кансервацыі сублімацыйнай сушкі дрожджаў і кішачнай палачкі.

Стратэгія, выкліканая абмежаваннямі

У Pichia pastoris такія абмежавальныя ўмовы, як нізкі ДА, канцэнтрацыя метанолу і абмежаванне кіслароду, узмацняюць экспрэсію рэкамбінантнага бялку. Умовы з абмежаваным паступленнем кіслароду актывуюць прамотар AOX1 праз назапашванне метанолу, павялічваючы выпрацоўку бялку пры зніжэнні цяпла. Індукцыя пры нізкай тэмпературы павышае ўраджайнасць, актыўнасць, стабільнасць і жыццяздольнасць клетак, але павялічвае выдаткі на астуджэнне. Абмежаванне рН і азоту таксама спрыяе экспрэсіі, што патрабуе асцярожнасці, каб пазбегнуць аперацыйных праблем. Абмежаванне азоту прыкметна павышае ўдзельную прадукцыйнасць бялку.

Yaohai Bio-Pharma таксама актыўна шукае інстытуцыйных або індывідуальных глабальных партнёраў і прапануе найбольш канкурэнтаздольную кампенсацыю ў галіны. Калі ў вас ёсць якія-небудзь пытанні, калі ласка, не саромейцеся звяртацца да нас: [email protected]