مرنا 3 'توصيف بولي (A).
مرنا 3 'توصيف بولي (A).
يعد ذيل 3' poly(A) (polyadenosines) من mRNA جزءًا لا يتجزأ من تنظيم ما بعد النسخ، مما يؤثر على تصدير mRNA واستقراره وترجمته. في حالة mRNAs المكتوبة في المختبر (IVT)، يتم تقديم ذيل poly(A) إما أثناء النسخ المشترك بطريقة مقولبة أو من خلال عملية المخلفات الأنزيمية بطريقة غير مقولبة. يعمل هذا 3′ poly(A) بمثابة سمة جودة حرجة (CQA) لـ IVT RNAs، مما يستلزم توصيفًا شاملاً أثناء تطوير العملية وإصدار الدفعة.
توفر شركة Yaohai Bio-Pharma خدمات متخصصة في توصيف البولي (A) 3'، باستخدام تقنيات مثل انقسام الريبونوكلياز T1 (RNase T1)، والتحليل اللوني السائل عالي الأداء ذو الطور العكسي (IP-RP-HPLC)/التحليل اللوني السائل - قياس الطيف الكتلي (LC-MS)، وتحليل شامل للبيانات.
المتطلبات التنظيمية لتوصيف mRNA 3' poly(A).
وفقًا للاعتبارات التنظيمية لمنظمة الصحة العالمية، "تعتبر سلامة بنية mRNA بمثابة سمة نوعية حاسمة لإطلاق mRNA. وبالتالي، هناك حاجة إلى التحكم من أجل سلامة mRNA، وكفاءة التغطية 5′، ووجود ذيل 3′ poly(A) أو طوله، وما إلى ذلك.
المنهج التحليلي
تحليل الأداء |
طرق |
مرنا 3 'توصيف بولي (A). |
LC-MS بعد الهضم |
العملية
الخطوة 1. انقسام RNase T1
يعد التحليل المباشر للرنا المرسال السليم كامل الطول بواسطة LC-MS غير عملي بسبب حجمه وعدم تجانسه. لفحص ذيل poly(A)، يجب أن يكون مشقوقًا من mRNA كامل الطول. تتضمن الطريقة السائدة الهضم الأنزيمي باستخدام RNase T1، مما يؤدي إلى شق الطرف 3′ من rG بشكل انتقائي مع الحفاظ على تسلسل poly(A). تخضع عينة mRNA لعملية الهضم باستخدام RNase T1، ويتم عزل شظايا الانقسام التي تحتوي على امتدادات poly(A) باستخدام الخرز المغناطيسي المطلي بـ oligo dT.
الخطوة 2. IP-RP-HPLC/LC-MS
خضعت الذيول المستخرجة للتحليل باستخدام LC-MS، مما يوفر معلومات دقيقة عن طول الذيل بدقة أحادية النوكليوتيدات. في تحليل قليل النوكليوتيد LC-MS، تعتبر عمليات فصل الطور العكسي (IP-RP) للاقتران الأيوني مع إضافات الطور المتحرك الأميني بمثابة الوضع الكروماتوغرافي المفضل، نظرًا لقدرتها التحليلية القوية وتوافقها مع قياس الطيف الكتلي (MS).
الخطوة 3. تحليل البيانات
يعتمد طول ذيل poly(A) ووفرته النسبية على عدد وكثافة القمم مقسومًا على كتلة الأدينوزين. عند معالجة أو فك طيف الكتلة، يتم تمييز الكتلة المتوقعة لذيل بولي (A) 100 مير (33,163 دا في الصندوق)، مصحوبة بسلسلة من الكتل متباعدة بـ 329 amu، أي ما يعادل كتلة الأدينوزين (A) .
حالة توصيف 3' poly(A) باستخدام LC-MS
لقد طورت Yaohai-BioPharma طريقة قوية لتوصيف mRNA 3' poly(A)، بما في ذلك انقسام RNase T1 وIP-RP-HPLC/LC-MS.
لقد طورت Yaohai-BioPharma طريقة قوية لتوصيف mRNA 3' poly(A)، بما في ذلك انقسام RNase T1 وIP-RP-HPLC/LC-MS.
EN
