مرنا 5'كفاءة السد
أهمية تحليل كفاءة mRNA 5'caping
يلعب هيكل الغطاء الموجود عند الطرف 5′ من الرنا المرسال دورًا محوريًا في الترجمة الفعالة وتثبيت ونقل الرنا المرسال داخل حقيقيات النوى. في سياق mRNA المكتوب في المختبر (IVT)، يتم تقديم الغطاء 5' من خلال عمليات السد النسخي المشترك أو عمليات السد الأنزيمية. باعتباره مكونًا لا غنى عنه في IVT RNAs، فإن الحد الأقصى 5 يمثل بمثابة سمة جودة حرجة (CQA) تتطلب توصيفًا شاملاً طوال تطوير العملية وإصدار الدُفعات.
توفر شركة Yaohai-Bio Pharma حلولًا شاملة لتحليل كفاءة التغطية مقاس 5 بوصات، تشمل تصميم جبائر قليل النوكليوتيد (المسبار)، وانقسام RNase H، وكروماتوجرافيا سائلة عالية الأداء IP-RP-Ion-pair عكسية الطور (IP-RP-HPLC)/تحليل كروماتوجرافي سائل. - قياس الطيف الكتلي (LC-MS)، تحليل البيانات.
المتطلبات التنظيمية لسلامة مرنا
وفقًا للاعتبارات التنظيمية لمنظمة الصحة العالمية، "تعتبر سلامة بنية mRNA بمثابة سمة نوعية حاسمة لإطلاق mRNA. وبالتالي، هناك حاجة إلى التحكم من أجل سلامة mRNA، وكفاءة التغطية 5′، ووجود ذيل 3′ poly(A) أو طوله، وما إلى ذلك.
المنهج التحليلي
تحليل الأداء |
طرق |
مرنا 5'كفاءة السد |
LC-MS بعد الهضم |
العملية
الخطوة 1. تصميم جبائر قليل النوكليوتيد (المسبار).
يعمل مسبار الانقسام، الذي يشتمل على 2'-O- ميثيل نيوكليوتيدات ورباعي أوكسي ريبونوكليوتيدات، على شق خيط RNA التكميلي في مواضع محددة عند وجود RNase H. تثبت هذه الطريقة أنها ذات قيمة عالية للجيل المستهدف من أجزاء الحمض النووي الريبي الأكبر حجمًا.
الخطوة 2. انقسام RNase H
يتم تطبيق مسبار أحيائي، مصمم استراتيجيًا ليكون مكملاً للنهاية 5' من الرنا المرسال، بالتزامن مع RNase H لتحفيز الانقسام المستهدف لأليغنوكليوتيد النهاية 5' الذي يمتلك هيكل الغطاء.
الخطوة 3. IP-RP-HPLC/LC-MS
في تحليل قليل النوكليوتيد LC-MS، يكون الوضع الكروماتوغرافي المفضل هو فصل الطور العكسي (IP-RP) بالاقتران الأيوني باستخدام إضافات الطور المتحرك الأميني. ويعزى ذلك إلى قوتها التحليلية الفائقة وتوافقها مع قياس الطيف الكتلي (MS).
الخطوة 4. تحليل البيانات
الكتل المميزة التي لوحظت في شظايا الانقسام التي تتميز بغطاء m7GpppG، على عكس تلك التي تحتوي على ثنائي الفوسفات أو ثلاثي الفوسفات أو غطاء G غير الميثيل (GpppG)، تسهل التعرف عليها وتمكن من تقدير كفاءة السد.
حالة تحديد سقف لتحليل الكفاءة باستخدام LC-MS
قامت شركة Yaohai-Bio Pharma بتطوير أساليب قوية لتحليل كفاءة تغطية mRNA، بدءًا من تصميم جبائر قليل النوكليوتيد (المسبار)، وانقسام RNase H، وIP-RP-HPLC/LC-MS إلى تحليل البيانات.
إجمالي اللوني الأيوني (يسار) وأطياف الكتلة الكهربائية (يمين) لشظايا الانقسام 5'end
EN
