מבנה הכובע הממוקם בקצה 5' של mRNA ממלא תפקיד מרכזי בתרגום, ייצוב והובלה יעילים של mRNA בתוך אוקריוטים. בהקשר של mRNA בתעתיק במבחנה (IVT), מכסה ה-5' מוכנס באמצעות תהליכי כיסוי קו-תעתוקתי או אנזימטיים. כמרכיב הכרחי של IVT RNAs, מכסה 5′ עומדת כתכונת איכות קריטית (CQA) המחייבת אפיון מקיף לאורך פיתוח התהליך ושחרור אצווה.
Yaohai-Bio Pharma מספקת פתרונות מקיפים לניתוח יעילות מכסה של 5', הכוללים עיצוב סדים של אוליגונוקלאוטידים (בדיקה), מחשוף RNase H, כרומטוגרפיית נוזלים עם ביצועים גבוהים IP-RP-Ion-pair reversed-phase (IP-RP-HPLC)/כרומטוגרפיה נוזלית. -ספקטרומטריית מסה (LC-MS), ניתוח נתונים.
על פי השיקולים הרגולטוריים של WHO, "שלמות המבנה של ה-mRNA נחשבת לתכונת איכות קריטית לשחרור ה-mRNA. לפיכך, יש צורך בשליטה על שלמות ה-mRNA, יעילות מכסה של 5', נוכחות או אורך זנב פולי(A) של 3' וכן הלאה."
אָנָלִיזָה |
שיטות |
יעילות mRNA 5'capping |
LC-MS לאחר עיכול |
בדיקת המחשוף, המשלבת 2'-O-methylnucleotides ו-tetradeoxyribonucleotides, משמשת לפיתוח גדיל RNA משלים במיקומים ספציפיים כאשר RNase H קיים. שיטה זו מתגלה כבעלת ערך רב עבור הדור הממוקד של שברי RNA גדולים יותר.
בדיקה ביוטיניל, שתוכננה אסטרטגית כדי להיות משלימה לקצה 5' של mRNA, מיושם בשילוב עם RNase H כדי לזרז את הביקוע הממוקד של אוליגונוקלאוטיד 5' קצה בעל מבנה מכסה.
בניתוח אוליגונוקלאוטידים LC-MS, המצב הכרומטוגרפי המועדף הוא הפרדות פאזה הפוכה (IP-RP) בשילוב יונים תוך שימוש בתוספי פאזה ניידת אמינים. זה מיוחס לכוח הפתרון המעולה שלהם ולתאימות עם ספקטרומטריית מסה (MS).
מסות ברורות שנצפו בשברי מחשוף הכוללים מכסה m7GpppG, בניגוד לאלו עם מכסה דיפוספט, טריפוספט או GpppG לא מתיל, מקלות על הזיהוי שלהם ומאפשרות הערכת יעילות המכסה.
Yaohai-Bio Pharma פיתחה שיטות חזקות לניתוח יעילות מכסת mRNA, החל מעיצוב סדים של אוליגונוקלאוטידים (בדיקה), מחשוף RNase H, IP-RP-HPLC/LC-MS ועד לניתוח נתונים.
סך כל כרומטוגרמות היונים (משמאל) וספקטרום המסה של ספריי אלקטרו (מימין) של שברי מחשוף 5'-end