Ξεκλειδώνοντας τα μυστικά της υψηλής ποιότητας εκχύλισης πλασμιδίου

Η εκχύλιση πλασμιδίου είναι ζωτικής σημασίας για τους ερευνητές. Ως φορείς γονιδίων, τα πλασμίδια είναι ζωτικής σημασίας για την έρευνα εμβολίων και τη γονιδιακή θεραπεία, όπου η ποιότητα έχει σημασία. Οι βασικοί ποιοτικοί παράγοντες περιλαμβάνουν την υπερτυλιγμένη αναλογία και την περιεκτικότητα σε ενδοτοξίνες. Οι κανονισμοί ποικίλλουν: FDA ≥80%, SMPA ≥85%, NMPA ≥90%, με <5% γραμμικό/ανοιχτό κυκλικό DNA. Οι πελάτες συχνά προτιμούν ≥95% supercoiled. Τα επίπεδα ενδοτοξίνης είναι: έρευνα (>50 EU/μg), επιμόλυνση (<50 EU/μg) και χωρίς ενδοτοξίνες (<0.1 EU/μg).

Υπερτυλιγμένο πλασμιδικό DNA

Τα πλασμίδια από την Escherichia coli περιλαμβάνουν υπερτυλιγμένο (SC), ανοιχτό κυκλικό (OC) και γραμμικό (L) DNA. Η υψηλή αναλογία SC ενισχύει την αποτελεσματικότητα και την έκφραση της επιμόλυνσης. Για παράδειγμα, η επιμόλυνση ενός πλασμιδίου SC 85.45% είναι 2.5 φορές υψηλότερη και η έκφραση HGF ενός πλασμιδίου SC 93.28% είναι 1.8 φορές υψηλότερη, επιβεβαιώνοντας την υπεροχή του SC DNA.

Ανοιχτό κυκλικό DNA: Όταν ένας κλώνος δίκλωνου DNA σπάσει, η υπερτυλιγμένη δομή χαλαρώνει, σχηματίζοντας ένα ανοιχτό κυκλικό πλασμίδιο με μεγαλύτερο όγκο που μεταναστεύει πιο αργά κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης και τοποθετείται στην κορυφή.

Γραμμικό DNA: Όταν και οι δύο κλώνοι του πλασμιδικού DNA σπάσουν, σχηματίζεται μια γραμμική δομή, με σχετικά μικρότερο όγκο που μεταναστεύει ταχύτερα από το ανοιχτό κυκλικό DNA αλλά πιο αργά από το υπερτυλιγμένο DNA, τοποθετημένο δεύτερο.

Υπερτυλιγμένο DNA: Δύο έλικες συμπλέκονται, συστρέφοντας σε μια υπερτυλιγμένη δομή που βασίζεται στην έλικα του DNA. Έχει τον μικρότερο όγκο και μεταναστεύει ταχύτερα κατά την ηλεκτροφόρηση, τοποθετημένο στο κάτω μέρος.

Ποσοτική Ανάλυση Υπερτυλιγμένης Αναλογίας

Τα εργαστήρια χρησιμοποιούν ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης (AGE) και αναλυτή Gel-Pro για να κρίνουν την αναλογία υπερσπειρώματος μέσω εικόνων ηλεκτροφόρησης. Μια εικόνα δείχνει 97.539% SC DNA, ενώ μια άλλη δείχνει 63.833% SC και 36.167% OC DNA (γραμμικό DNA δεν είναι ορατό).

Το μυστικό της ενδοτοξίνης στα πλασμίδια

Η ενδοτοξίνη είναι ένα συστατικό του εξωτερικού στρώματος του κυτταρικού τοιχώματος των Gram-αρνητικών βακτηρίων, που απελευθερώνεται μετά από βακτηριακό θάνατο ή λύση, και περιέχει τοξικό λιποπολυσακχαρίτη Α. Κατά την εκχύλιση του πλασμιδίου, η ενδοτοξίνη εισέρχεται στο διάλυμα λύσης, επηρεάζοντας την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης και πυροδοτώντας μη ειδικές ανοσολογικές αποκρίσεις, οδηγώντας σε ψευδώς θετικά αποτελέσματα σε πειράματα.

Ποσοτική και Ποιοτική Ανάλυση Ενδοτοξίνης

Η δοκιμή Limulus amebocyte lysate (LAL) ανιχνεύει την ενδοτοξίνη μέσω συγκόλλησης με 2-κετο-3-δεοξυοκτονικό οξύ (KDO) στον λιποπολυσακχαρίτη (LPS). Είναι ποιοτικό και ημιποσοτικό, υποδεικνύοντας την παρουσία ενδοτοξίνης μέσω πήξης ή αλλαγής χρώματος όταν αναμιγνύεται με δείγματα.

Η Yaohai Bio-Pharma προσφέρει υπερτυλιγμένα πλασμίδια χωρίς ενδοτοξίνες. Η εξωτερική ανάθεση στο Yaohai ενισχύει τη διαμόλυνση και την αποτελεσματικότητα έκφρασης. Τα χορηγούμενα πλασμίδια έχουν αναλογία SC ≥95% (μέσος όρος 85%±10%) και επίπεδα ενδοτοξίνης ≤0.1, ≤0.01 ή ≤0.005 EU/μg.

Αναζητούμε επίσης ενεργά θεσμικούς ή μεμονωμένους παγκόσμιους εταίρους. Προσφέρουμε την πιο ανταγωνιστική αποζημίωση στον κλάδο. Εάν έχετε οποιεσδήποτε ερωτήσεις, μη διστάσετε να επικοινωνήσετε μαζί μας: [email protected]