Διαδικασία κατασκευής mRNA eGFP

Η παραγωγή του mRNA eGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) περιλαμβάνει μια σειρά τεχνικών μοριακής βιολογίας για τη δημιουργία ενός λειτουργικού μορίου RNA που κωδικοποιεί την έκφραση του eGFP. Στον τομέα του mRNA eGFP, η Yaohai Bio-Pharma έχει συσσωρεύσει εκτενή εμπειρία στην κάλυψη των ειδικών αναγκών των πελατών. Αξιοποιώντας την εμπειρία μας, έχουμε συνθέσει τη ροή της διαδικασίας για την παραγωγή EGFP mRNA.

1. Κλωνοποίηση του γονιδίου eGFP: Για να ληφθεί η γονιδιακή αλληλουχία που κωδικοποιεί για eGFP. Αυτό το γονίδιο τυπικά κλωνοποιείται από έναν προϋπάρχοντα φορέα πλασμιδίου ή συντίθεται τεχνητά με βάση τη γνωστή αλληλουχία νουκλεοτιδίων. Το κλωνοποιημένο γονίδιο επαληθεύεται στη συνέχεια μέσω προσδιορισμού αλληλουχίας για να εξασφαλιστεί η ακρίβεια.
2. Γονιδιακή Βελτιστοποίηση για Έκφραση: Για βέλτιστη έκφραση στο σύστημα στόχο (π.χ. κύτταρα θηλαστικών, βακτήρια ή in vitro συστήματα μεταγραφής), το γονίδιο eGFP μπορεί να υποβληθεί σε βελτιστοποίηση κωδικονίων. Αυτό περιλαμβάνει την αντικατάσταση σπάνιων κωδικονίων στην αρχική αλληλουχία με πιο συχνά χρησιμοποιούμενα στον οργανισμό ξενιστή, αυξάνοντας τις πιθανότητες αποτελεσματικής μετάφρασης.
3. In vitro Προετοιμασία προτύπου μεταγραφής: Μόλις το βελτιστοποιημένο γονίδιο είναι έτοιμο, ενσωματώνεται σε έναν κατάλληλο φορέα, συχνά ένα πλασμίδιο, που περιέχει ρυθμιστικά στοιχεία απαραίτητα για τη μεταγραφή (π.χ. μια αλληλουχία προαγωγέα). Αυτό το πλασμίδιο χρησιμεύει ως εκμαγείο για in vitro μεταγραφή.
4. In vitro Μεταγραφή: Χρησιμοποιώντας το παρασκευασμένο εκμαγείο πλασμιδίου, πραγματοποιείται in vitro μεταγραφή για τη σύνθεση mRNA του eGFP. Αυτή η διαδικασία περιλαμβάνει τη χρήση ενζύμων RNA πολυμεράσης, τα οποία αναγνωρίζουν την αλληλουχία προαγωγέα και ξεκινούν τη μεταγραφή, παράγοντας έναν συμπληρωματικό κλώνο RNA στο εκμαγείο DNA. Ανάλογα με την επιθυμητή εφαρμογή, το mRNA μπορεί να καλυφθεί, να πολυαδενυλιωθεί και/ή να τροποποιηθεί για να ενισχυθεί η σταθερότητα και η απόδοση μετάφρασης.
5. Καθαρισμός και Ποιοτικός Έλεγχος: Το συντιθέμενο mRNA eGFP στη συνέχεια καθαρίζεται για να αφαιρεθούν τυχόν μολυντές, συμπεριλαμβανομένων του DNA, των πρωτεϊνών και των ελεύθερων νουκλεοτιδίων. Οι μέθοδοι καθαρισμού μπορεί να περιλαμβάνουν ηλεκτροφόρηση γέλης, χρωματογραφία στήλης ή διαχωρισμό με βάση σφαιρίδια. Μετά τον καθαρισμό, το mRNA αναλύεται ως προς την ποιότητα, συμπεριλαμβανομένης της συγκέντρωσης, της καθαρότητας και της ακεραιότητας, χρησιμοποιώντας τεχνικές όπως η φασματοφωτομετρία UV-Vis και η ηλεκτροφόρηση γέλης.
6. Αποθήκευση και παράδοση: Το καθαρισμένο mRNA του eGFP συνήθως αποθηκεύεται σε χαμηλές θερμοκρασίες για τη διατήρηση της σταθερότητας. Για πειραματική χρήση, το mRNA μπορεί να απελευθερωθεί σε κύτταρα χρησιμοποιώντας διάφορες μεθόδους, όπως ηλεκτροδιάτρηση, λιπομόλυνση ή ιικούς φορείς, ανάλογα με τη συγκεκριμένη εφαρμογή και τον τύπο του κυττάρου στόχου.
7. Έκφραση και επαλήθευση: Μόλις εισέλθει στο κύτταρο, το mRNA του eGFP μεταφράζεται στην ενισχυμένη πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη, η οποία μπορεί να οπτικοποιηθεί χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού. Αυτό επιτρέπει την επαλήθευση της επιτυχούς παραγωγής, παράδοσης και έκφρασης mRNA.

Συνοπτικά, η παραγωγή του mRNA του eGFP περιλαμβάνει κλωνοποίηση του γονιδίου, βελτιστοποίησή του για έκφραση, προετοιμασία μήτρας μεταγραφής in vitro, εκτέλεση της αντίδρασης μεταγραφής, καθαρισμό του mRNA που προκύπτει και, τέλος, παράδοση σε κύτταρα για έκφραση και επαλήθευση.

Αναζητούμε επίσης ενεργά θεσμικούς ή μεμονωμένους παγκόσμιους εταίρους. Προσφέρουμε την πιο ανταγωνιστική αποζημίωση στον κλάδο. Εάν έχετε οποιεσδήποτε ερωτήσεις, μη διστάσετε να επικοινωνήσετε μαζί μας: [email protected]