Διαδικασία Παραγωγής του eGFP mRNA

Η παραγωγή μRNA του eGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) περιλαμβάνει μια σειρά τεχνικών μοριακής βιολογίας για να δημιουργηθεί ένα λειτουργικό μόριο RNA που κωδικοποιεί την έκφραση του eGFP. Στον τομέα του μRNA του eGFP, το Yaohai Bio-Pharma έχει συσσωρεύσει εκτεταμένη εμπειρία στην απαντήσει στις συγκεκριμένες ανάγκες των πελατών. Με τη χρήση της εμπειρίας μας, έχουμε συντομεύσει το ρολόι παραγωγής του mRNA EGFP.

1. Κλωνοποίηση του Γονιδίου eGFP : Να το πάρει το γονιδιακό ακολουθία που κωδικοποιεί το eGFP. Αυτό το γονίδιο συνήθως κλωνοποιείται από ένα υπάρχον πλάσμα ή συντεθείται τεχνικά με βάση το γνωστό ακολουθία νουκλεοτιδίων. Το κλωνοποιημένο γονίδιο επαληθεύεται μετά μέσω ακολουθιασμού για να εξασφαλιστεί η ακρίβεια.
2. Βελτιστοποίηση Γονιδίου για Έκφραση : Για αποτελεσματικότερη έκφραση στον στόχο σύστημα (π.χ., κυτώματα μάμμαλων, βακτήρια ή συστήματα μετάφρασης in vitro), το γονίδιο eGFP μπορεί να υποβληθεί σε εξυπηρέτηση κώδικα. Αυτό περιλαμβάνει την αντικατάσταση σπάνιων κώδικων στην αρχική ακολουθία με πιο συχνά χρησιμοποιούμενους στον φιλοξενούμενο οργανισμό, αυξάνοντας τις πιθανότητες αποτελεσματικής μετάφρασης.
3. In vitro Προετοιμασία προtypoύ για μετάφραση : Μόλις το εξυπηρετημένο γονίδιο είναι έτοιμο, ενσωματώνεται σε έναν κατάλληλο διανοστή, συχνά ένα πλάσμα, που περιέχει κανονιστικά στοιχεία που απαιτούνται για τη μετάφραση (π.χ., μια ακολουθία προαγωγέα). Αυτό το πλάσμα λειτουργεί ως πρότυπο για μετάφραση in vitro.
4. In vitro Μετάφραση : Χρησιμοποιώντας το προετοιμασμένο πλάσματος υποδείγμα, εκτελείται εξωτερική μεταφορά για να συνθέσετε mRNA eGFP. Αυτή η διαδικασία περιλαμβάνει τη χρήση ζυμωτικών RNA polymerase, τα οποία αναγνωρίζουν την ακολουθία προαγωγέα και εκκινούν τη μεταφορά, παράγοντας μια συμπληρωματική καταχώρηση RNA με το DNA υπόδειγμα. Λογώ της επιθυμητής εφαρμογής, το mRNA μπορεί να κορυφωθεί, να πολυαδενυληθεί και/ή να τροποποιηθεί για να ενισχυθεί η σταθερότητα και η αποδοση μετάφρασης.
5. Καθαρισμός και Έλεγχος Ποιότητας : Το συντεθέν mRNA eGFP καθαρίζεται στη συνέχεια για να αφαιρεθούν οποιεσδήποτε ρυπογόνες ουσίες, συμπεριλαμβανομένων του DNA, των πρωτεινών και των ελεύθερων νουκλεοτιδίων. Οι μέθοδοι καθαρισμού μπορούν να περιλαμβάνουν γελιοειδή ηλεκτροφόρηση, κρούσμα στήλης ή αποχώρηση με βάση μπάλες. Μετά τον καθαρισμό, το mRNA αναλύεται για ποιότητα, συμπεριλαμβανομένων της συγκέντρωσης, της καθαρότητας και της ακεραιότητας, χρησιμοποιώντας τεχνικές όπως την φασματοφωτομετρία UV-Vis και τη γελιοειδή ηλεκτροφόρηση.
6. Αποθήκευση και Μεταφορά : Το καθαρισμένο mRNA eGFP αποθηκεύεται συνήθως σε χαμηλές θερμοκρασίες για να διατηρείται η σταθερότητά του. Για πειραματική χρήση, το mRNA μπορεί να μεταφερθεί σε κύτταρα με διάφορες μεθόδους, συμπεριλαμβανομένης της ελεκτροπορείας, της λιποφάκτωσης ή των ιογονικών διανοσητών, ανάλογα με τη συγκεκριμένη εφαρμογή και τον τύπο κυττάρων.
7. Έκφραση και Επαλήθευση : Μόλις μέσα στο κύτταρο, το mRNA eGFP μεταφράζεται στο πρωτεΐνη ενισχυμένου πράσινου φλεβωτικού φωτισμού, η οποία μπορεί να παρατηρηθεί με χρήση μικροσκοπίας φλεβωτικότητας. Αυτό επιτρέπει την επαλήθευση επιτυχούς παραγωγής, μεταφοράς και έκφρασης mRNA.

Συνοψίζοντας, η παραγωγή mRNA eGFP περιλαμβάνει το κλωνογράφημα του γονιδίου, την πτυχέυση του για έκφραση, την προετοιμασία ενός προτύπου για μεταφορά in vitro, την εκτέλεση της αντίδρασης μεταφοράς, την καθαρισμό του αποτελεσματικού mRNA και τελικά τη μεταφορά του σε κύτταρα για έκφραση και επαλήθευση.

Επιζητούμε ενεργά παγκόσμιους συνεργάτες, ιδρύματα ή μεμονωμένες οντότητες. Προσφέρουμε την πιο ανταγωνιστική αποζητητική στον τομέα. Εάν έχετε κάποιες ερωτήσεις, μην διστάσετε να μας επικοινωνήσετε: [email protected]