Παρασκευή IVT mRNA

Η εκτός οργανισμού μεταφορά (IVT) είναι η προτιμώμενη μέθοδος για την παρασκευή mRNA, ικανή να παράγει μικρογράμματα έως μιλλιγράμματα mRNA σε επιπέδο εργαστηρίου. Για έρευνα, οι παραγωγοί υλικών έχουν αναπτύξει ευέλικτα συστήματα αντιδράσεων IVT που είναι κατάλληλα για mRNA μετριασμένης μήκους (1000-4000 νουκλεοτίδες).

Σε αυτό το άρθρο, θα επισυνάψουμε την εκτός οργανισμού μεταφορά (IVT) mRNA, περιλαμβανομένου του παραδοσιακού συστήματος αντιδράσεων IVT που χρησιμοποιείται σε επίπεδο εργαστηρίου και του συστήματος αντιδράσεων IVT που είναι κατάλληλο για εξαιρετικά μεγάλο mRNA (>9000 νουκλεοτίδες).

Τα συστήματα επιτρέπουν τη συνδιασιακή κάπαξη με CleanCap AG και μειώνουν την ανοσογεννητικότητα με m1ψ. Το DNase I αφαιρεί το υπόλοιπο DNA. Η χαμηλή απόδοση μπορεί να οφείλεται σε κακή αναμίξη, οξείδωση υλικών ή προβλήματα με το DNA πρότυπο, τα οποία μπορούν να αντιμετωπιστούν με κεντριφυγή, ανανεωμένα υλικά, ελέγχους και τροποποίηση του ποσού προτύπου/χρόνου αντιδράσεως.

Η Yaohai Bio-Pharma προσφέρει διάφορα προετοιμασμένα προϊόντα IVT RNA (υγρό/ξηρό πουλβέρι) και τελικά προϊόντα LNP, με κωδικοποίηση πρωτεΐνων όπως φωτιστικές πρωτεΐνες (eGFP, mCHERRY), λουσιφέρας, επανασυνθετικό Cre και αντιγόνο OVA, για να καλύψει διαφορετικές πειραματικές ή προ젝τους ανάγκες.

Σύστημα IVT για υπερδιάσπαστο mRNA

Το συνηθισμένο IVT δεν λειτουργεί για υπερμεγάλη mRNA (>9000 nt). Χρειάζεται βαθιά κατανόηση και λογική προσαρμογή των συστατικών IVT.

DNA Πρό摸型: Γραμμικοποιημένα πλάσματα ή προϊόντα PCR με τις αντίστοιχες ακολουθίες προωθητή, διαλυμένα σε RNase-free H2O. Συστεί επιπλέον συγκέντρωση DNA πρότυπου υψηλότερη των 40 nM για καλύτερες συνθήκες IVT.

DTT: Διατηρεί την ενεργειακότητα των ενζυμάτων κατά τη μεταγραφή. Θα πρέπει να προστίθεται απόκαιρο DTT στο φυσικό φύλλο για καλύτερη ενεργειακότητα των ενζυμάτων.

Ινιβιτόρας RNase: Αποτρέπει την δραστηριότητα της RNase και διατηρεί τη σταθερότητα του mRNA.

Πολυμεράς RNA T7: Καταλύει τη μεταγραφή DNA σε RNA, αντίστοιχα με την ακολουθία προωθητή. Η δραστηριότητα του πολυμεράση RNA T7 επηρεάζεται από το pH και τα ιόντα μαγνήσιου.

Ιόντα Μαγνήσιου (Mg2+): Ένας συντρόφος για την πολυμεράση RNA. Πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις μειώνουν την αποδοσία της μεταγραφής, ενώ πολύ υψηλές συγκεντρώσεις οδηγούν στην κατάρρευση του RNA. Το ελεύθερο [Mg2+] θα πρέπει να συντονιστεί βάσει της συγκεντρώσεως νουκλεοτιδίων. Κάθε νουκλεοτιδίο δέσει ένα [Mg2+], έτσι η συγκεντρώση [Mg2+] θα πρέπει να υπερβαίνει τη συνολική συγκεντρώση των νουκλεοτιδίων.

Τριφοσφορικά Νουκλεοσίδια (NTP): Ως υποστρώγγυλα, τα NTP είναι τα βασικά μονάδια του RNA. Συγκεντρώσεις NTP πάνω από 7 mM έχουν θετική επίδραση στην παραγωγή mRNA.

Σπερμίνη: Διατηρεί τους συνδυασμούς DNA-ενζυματικών και προκαλεί μεταγραφικές αντιδράσεις. Ωστόσο, υπερβολικές συγκεντρώσεις έχουν εμποδιστικές επιπτώσεις. Η προτεινόμενη συγκεντρώση σπερμίνης είναι μεταξύ 1 και 3 mM.

Ανοργανικός Πυροφοσφορολάσης (PPase): Προστέθηκε στις αντιδράσεις IVT για να επιβλέπεται η πίστωση των ιόνων ανοργανικού πυροφοσφάτου (PPi), αποφεύγοντας τη χημείωσή τους με Mg2+ και εξασφαλίζοντας αρκετό ελεύθερο Mg2+.

Χρησιμοποιώντας πρωτοποριακή τεχνολογία και εμπειρία σε IVT mRNA, το Yaohai Bio-Pharma προσφέρει μια υπηρεσία IVT RNA με μία στάση, περιλαμβάνοντας σχεδιασμό ακολουθίας, προετοιμασία IVT RNA (με τροποποιήσεις m1ψ), κυκλικοποίηση RNA, καθαρισμό, ξηρασμό, ενσωμάτωση LNP και ελέγχους ποιότητας.

Επιζητούμε ενεργά παγκόσμιους συνεργάτες, ιδρύματα ή μεμονωμένες οντότητες. Προσφέρουμε την πιο ανταγωνιστική αποζητητική στον τομέα. Εάν έχετε κάποιες ερωτήσεις, μην διστάσετε να μας επικοινωνήσετε: [email protected]