IVT mRNA Παρασκευή

Η in vitro μεταγραφή (IVT) είναι η προτιμώμενη μέθοδος για την παρασκευή mRNA, ικανή να αποδίδει μικρογραμμάρια έως χιλιοστόγραμμα mRNA σε εργαστηριακή κλίμακα. Για ερευνητικούς σκοπούς, οι προμηθευτές αντιδραστηρίων έχουν αναπτύξει ευέλικτα συστήματα αντίδρασης IVT κατάλληλα για mRNA μέτριου μήκους (1000-4000 νουκλεοτίδια).

Σε αυτό το άρθρο, θα συνοψίσουμε την in vitro μεταγραφή (IVT) του mRNA, συμπεριλαμβανομένου του συμβατικού συστήματος αντίδρασης IVT που χρησιμοποιείται σε εργαστηριακή κλίμακα και του συστήματος αντίδρασης IVT που είναι κατάλληλο για εξαιρετικά μεγάλο mRNA (>9000 νουκλεοτίδια).

Τα κιτ επιτρέπουν τη συν-μεταγραφική κάλυψη με το CleanCap AG και μειώνουν την ανοσογονικότητα με το m1ψ. Η DNase I αφαιρεί το υπολειμματικό DNA. Η χαμηλή απόδοση μπορεί να οφείλεται σε προβλήματα κακής ανάμειξης, οξείδωσης αντιδραστηρίου ή προτύπου DNA, τα οποία μπορούν να μετριαστούν με φυγοκέντρηση, φρέσκα αντιδραστήρια, μάρτυρες και προσαρμογή της ποσότητας προτύπου/χρόνου αντίδρασης.

Η Yaohai Bio-Pharma παρέχει διάφορα προκατασκευασμένα προϊόντα IVT RNA (υγρή/λυοφιλοποιημένη σκόνη) και τελικά προϊόντα LNP, που κωδικοποιούν πρωτεΐνες όπως φθορίζουσες πρωτεΐνες (eGFP, mCHERRY), λουσιφεράση, recombinase Cre και αντιγόνο OVA, για να συναντήσουν διαφορετικά πειραματικά ή έργα αναγκαία.

Σύστημα IVT για εξαιρετικά μακρύ mRNA

Η συμβατική IVT μπορεί να μην λειτουργεί για υπερβολικά μεγάλο mRNA (>9000 nt). Απαιτείται βαθιά κατανόηση και ορθολογική προσαρμογή των στοιχείων IVT.

Πρότυπο DNA: Γραμμικοποιημένα πλασμίδια ή προϊόντα PCR με αντίστοιχες αλληλουχίες προαγωγέα, διαλυμένα σε H2O χωρίς RNase. Συνιστάται συγκέντρωση προτύπου DNA μεγαλύτερη από 40 nM για βέλτιστες συνθήκες IVT.

DTT: Διατηρεί την ενζυμική δραστηριότητα κατά τη μεταγραφή. Φρέσκο ​​DTT πρέπει να προστεθεί στο ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης για βέλτιστη ενζυμική δραστηριότητα.

Αναστολέας RNase: Αναστέλλει τη δραστηριότητα της RNase και διατηρεί τη σταθερότητα του mRNA.

Τ7 RNA Πολυμεράση: Καταλύει τη μεταγραφή DNA σε RNA, που αντιστοιχεί στην αλληλουχία προαγωγέα. Η δραστηριότητα της Τ7 RNA πολυμεράσης επηρεάζεται από το pH και τα ιόντα μαγνησίου.

Ιόντα μαγνησίου (Mg2+): Ένας συμπαράγοντας για την RNA πολυμεράση. Οι πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις μειώνουν την αποτελεσματικότητα της μεταγραφής, ενώ οι πολύ υψηλές συγκεντρώσεις οδηγούν σε υποβάθμιση του RNA. Το ελεύθερο [Mg2+] θα πρέπει να ρυθμίζεται με βάση τη συγκέντρωση νουκλεοτιδίων. Κάθε νουκλεοτίδιο χηλοποιεί ένα [Mg2+], επομένως η συγκέντρωση [Mg2+] θα πρέπει να υπερβαίνει τη συνολική συγκέντρωση νουκλεοτιδίου.

Τριφωσφορικά νουκλεοσίδια (NTP): Ως υποστρώματα, τα NTPs είναι οι βασικές μονάδες του RNA. Οι συγκεντρώσεις NTP πάνω από 7 mM έχουν θετικό αντίκτυπο στην παραγωγή mRNA.

Σπερμιδίνη: Σταθεροποιεί τα σύμπλοκα DNA-ενζύμων και διεγείρει τις αντιδράσεις μεταγραφής. Ωστόσο, οι υπερβολικές συγκεντρώσεις έχουν ανασταλτικά αποτελέσματα. Η συνιστώμενη συγκέντρωση σπερμιδίνης είναι μεταξύ 1 και 3 mM.

Ανόργανη πυροφωσφατάση (PPase): Προστέθηκε στις αντιδράσεις IVT για την πρόληψη της συσσώρευσης ανόργανων πυροφωσφορικών ιόντων (PPi), αποφεύγοντας τη χηλίωσή τους με Mg2+ και διασφαλίζοντας επαρκές ελεύθερο Mg2+.

Αξιοποιώντας την πρωτοποριακή τεχνολογία και την εμπειρία mRNA IVT, η Yaohai Bio-Pharma παρέχει μια υπηρεσία IVT RNA μιας στάσης, που περιλαμβάνει σχεδιασμό ακολουθίας, προετοιμασία IVT RNA (με m1ψ mods), κυκλοποίηση RNA, καθαρισμό, ξήρανση με κατάψυξη, ενθυλάκωση LNP και δοκιμή ποιότητας.

Αναζητούμε επίσης ενεργά θεσμικούς ή μεμονωμένους παγκόσμιους εταίρους. Προσφέρουμε την πιο ανταγωνιστική αποζημίωση στον κλάδο. Εάν έχετε οποιεσδήποτε ερωτήσεις, μη διστάσετε να επικοινωνήσετε μαζί μας: [email protected]