Επινοημένες τεχνικές συναρμολόγησης για μεγάλη κλίμακα σύνθεσης γονιδίων

Η τεχνολογία συνένωσης για τη σύνθεση μεγάλων κομματιών DNA από την αρχή είναι η βάση της σύνθεσης γενών, περιλαμβάνοντας μεθόδους όπως BioBrick™, TAR, BglBrick, Golden Gate, Gibson assembly, CPEC και Overlap PCR. Λόγω των περιορισμών της τρέχουσας τεχνολογίας να συντάσσει με ακρίβεια DNA της μήκους γενών σε μια μοναδική φάση, είναι απαραίτητο να συνδυάζουμε τεχνικές συνένωσης in vitro και in vivo για να συντάξουμε τα κομμάτια ολιγονουκλεοτίδων που συντάσσονται σε τμήματα σε μεγάλα κομμάτια DNA.

Τεχνικές συνένωσης in vitro

Κατατάσσονται σε διάφορες μεθόδους βάσει της μεγέθους κλάσματος και των χαρακτηριστικών ακολουθίας, με κοινή απαίτηση για τη χρήση εργαλειών ενζυμών. Η Overlap PCR, που βασίζεται στη μέθοδο DNA polymerase, είναι απλή και γρήγορη στη λειτουργία. Οι μέθοδοι BioBrick και BglBrick, που βασίζονται σε isoschizomers, επιτρέπουν πρότυπη συνέλευση, αν και η μέθοδος BioBrick δεν είναι επιτρεπτή για φυσικά πρωτεΐνες. Η μέθοδος κλωνοποίησης Golden Gate, που βασίζεται σε ενζύματα περιορισμού τύπου IIS, επιτρέπει αποτελεσματική άνευ ορίων σύνδεση πολλαπλών κλασμάτων. Η μέθοδος συνέλευσης Gibson, που χρησιμοποιεί συνδυασμό πολλαπλών εργαλείων ενζυμών, επιτρέπει άνευ ορίων σύνδεση με μέγεθος κλασμάτων που φθάνει αρκετά εκατοντάδες kb. Η πρότυπη σχεδιασμένη αρχιτεκτονική των συστατικών DNA ενισχύει το ποσοστό χρήσης υπάρχοντων κλασμάτων.

Τεχνικές συνέλευσης in vivo

Αν και in vitro τα συντεταγμένα κλάσματα μπορούν να φθάσουν σε μέγεθος αρκετά εκατοντάδες kb, αλλά η απόδοση είναι συχνά ανεπαρκής, απαιτώντας επιτόξευση με χρήση οργανισμών όπως Escherichia coli. Στη συνέλιξη κομμάτων μεγαλύτερων των 20 κβ, συχνά χρησιμοποιούνται αναδιπλασιαστικά συστήματα μέσα από οργανισμούς, περιλαμβανομένων του Bacillus subtilis, της μάγειρας και γενετικά τροποποιημένων βακτηρίων. Η μάγειρα, ως κοινώς χρησιμοποιούμενος φιλοξενικός οργανισμός, έχει αναγνωριστεί για την αποτελεσματική της ικανότητα ομοιογενούς αναδιπλασιασμού για πολλά χρόνια. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να συνέλειξε τα παραγωγικά κρωματοσώματα μέχρι και δεκάδων μεγαβάσεων (Mb) σε μέγεθος. Επιπλέον, η Saccharomyces cerevisiae εκφράζει μια εξαιρετική ανεξαρτησία από το μήκος των κρωματοσωμάτων, παρέχοντας μια θεωρητική βάση για τη χρήση μάγειρας στην κατασκευή υπερδιάστατων κρωματοσωμάτων σε υψηλότερους οργανισμούς.

Εφαρμογές

Η Yaohai Bio-Pharma χρησιμοποιεί κυρίως δύο μέθοδους συνέλευσης για τη σύνθεση γονιδίων: τη μέθοδο συνδεσιμότητας και τη μέθοδο συνέλευσης DNA πολυμεράσης. Η μέθοδος συνδεσιμότητας συνδέει τα επικαλυπτόμενα και υβριδωμένα τμήματα 5'-φοσφορυλούμενων ολιγονουκλεοτιδίων σε διγραμμικό DNA χρησιμοποιώντας DNA ligase. Η μέθοδος συνέλευσης πολυμεράσης χρησιμοποιεί DNA πολυμεράσα για να επεκτείνει τα επικαλυπτόμενα τμήματα ολιγονουκλεοτιδίων μέσω υβριδωμένων, προκαλώντας μίξεις διαφόρων μεγεθών, και τελικά επιτείνει τα επιτυχώς συναρμοσμένα τμήματα πλήρους μήκους με τη χρήση πρωτοβάδων. Η Yaohai μπορεί να βοηθήσει τους πελάτες να ικανοποιήσουν συγκεκριμένες απαιτήσεις στη σύνθεση γονιδίων.

Επιζητούμε ενεργά παγκόσμιους συνεργάτες, ιδρύματα ή μεμονωμένες οντότητες. Προσφέρουμε την πιο ανταγωνιστική αποζητητική στον τομέα. Εάν έχετε κάποιες ερωτήσεις, μην διστάσετε να μας επικοινωνήσετε: [email protected]