Καινοτόμες τεχνικές συναρμολόγησης για σύνθεση γονιδίων μεγάλης κλίμακας

Η τεχνολογία συναρμολόγησης για τη σύνθεση μεγάλων θραυσμάτων DNA από την αρχή είναι ο ακρογωνιαίος λίθος της γονιδιακής σύνθεσης, που περιλαμβάνει μεθόδους όπως BioBrick™, TAR, BglBrick, Golden Gate, Gibson assembly, CPEC και Overlap PCR. Λόγω των περιορισμών της τρέχουσας τεχνολογίας στην ακριβή σύνθεση DNA μήκους γονιδίου σε ένα μόνο βήμα, είναι απαραίτητος ο συνδυασμός τεχνικών συναρμολόγησης in vitro και in vivo για τη συναρμολόγηση θραυσμάτων ολιγονουκλεοτιδίων που συντίθενται σε τμήματα σε μακρά θραύσματα DNA.

Τεχνικές συναρμολόγησης in vitro

Ταξινομούνται σε διάφορες μεθόδους με βάση το μέγεθος του θραύσματος και τα χαρακτηριστικά αλληλουχίας, με κοινή απαίτηση για χρήση ενζύμων εργαλείων. Η Overlap PCR, βασισμένη στη μέθοδο της DNA πολυμεράσης, είναι απλή και γρήγορη στη λειτουργία. Οι μέθοδοι BioBrick και BglBrick, οι οποίες βασίζονται σε ισοσχιζομερή, επιτρέπουν την τυποποιημένη συναρμολόγηση, αν και η μέθοδος BioBrick είναι ακατάλληλη για πρωτεΐνες σύντηξης. Η μέθοδος κλωνοποίησης Golden Gate, που βασίζεται σε ένζυμα περιορισμού τύπου IIS, επιτρέπει την αποτελεσματική απρόσκοπτη απολίνωση πολλαπλών θραυσμάτων. Η μέθοδος συναρμολόγησης Gibson, η οποία χρησιμοποιεί έναν συνδυασμό πολλαπλών ενζύμων εργαλείων, επιτρέπει την απρόσκοπτη σύνδεση με μεγέθη θραυσμάτων που φτάνουν αρκετές εκατοντάδες kb. Ο τυποποιημένος σχεδιασμός των συστατικών του DNA ενισχύει τον ρυθμό χρήσης των υπαρχόντων θραυσμάτων.

Τεχνικές συναρμολόγησης in vivo

Αν και in vitro Τα συναρμολογημένα θραύσματα μπορούν να φτάσουν σε αρκετές εκατοντάδες kb σε μέγεθος, η απόδοση είναι συχνά ανεπαρκής, απαιτώντας την ενίσχυση χρησιμοποιώντας οργανισμούς όπως π.χ. Escherichia coli. Στη συναρμολόγηση θραυσμάτων που υπερβαίνουν τα 20 kb, συχνά χρησιμοποιούνται ανασυνδυασμένα συστήματα εντός οργανισμών, συμπεριλαμβανομένων των Bacillus subtilis, ζυμομυκήτων και κατασκευασμένων βακτηρίων. Η ζύμη, ως ένας ευρέως χρησιμοποιούμενος ξενιστής, έχει αναγνωριστεί για την αποτελεσματική ικανότητα ομόλογου ανασυνδυασμού της εδώ και πολλά χρόνια. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη συναρμολόγηση τεχνητών χρωμοσωμάτων μήκους έως και πολλών μεγαβάσεων (Mb). Επιπλέον, το Saccharomyces cerevisiae παρουσιάζει μια εξαιρετική ανοχή για το μήκος των χρωμοσωμάτων, παρέχοντας μια θεωρητική βάση για τη χρήση ζυμομυκήτων για την κατασκευή εξαιρετικά μακρών χρωμοσωμάτων σε ανώτερους οργανισμούς.

Εφαρμογές

Η Yaohai Bio-Pharma χρησιμοποιεί κυρίως δύο μεθόδους συναρμολόγησης για τη γονιδιακή σύνθεση: συγκρότηση λιγάσης και συγκρότηση πολυμεράσης DNA. Η μέθοδος συναρμολόγησης λιγάσης συνδέει επικαλυπτόμενα και υβριδοποιημένα 5'-φωσφορυλιωμένα ολιγονουκλεοτιδικά θραύσματα σε δίκλωνο DNA χρησιμοποιώντας λιγάση DNA. Η μέθοδος συναρμολόγησης πολυμεράσης χρησιμοποιεί πολυμεράση DNA για να επεκτείνει τα επικαλυπτόμενα ολιγονουκλεοτιδικά θραύσματα μέσω υβριδισμού, λαμβάνοντας ένα μείγμα διαφορετικών μηκών και τελικά ενισχύοντας τα επιτυχώς συναρμολογημένα πλήρους μήκους θραύσματα χρησιμοποιώντας εκκινητές. Το Yaohai's μπορεί να βοηθήσει τους πελάτες να ικανοποιήσουν συγκεκριμένες απαιτήσεις στη σύνθεση γονιδίων.

Αναζητούμε επίσης ενεργά θεσμικούς ή μεμονωμένους παγκόσμιους εταίρους. Προσφέρουμε την πιο ανταγωνιστική αποζημίωση στον κλάδο. Εάν έχετε οποιεσδήποτε ερωτήσεις, μη διστάσετε να επικοινωνήσετε μαζί μας: [email protected]