mRNA 3' پولی(A) کی خصوصیت
mRNA 3' پولی(A) کی خصوصیت
mRNA کی 3' پولی (A) ٹیل (پولیڈینوسینز) پوسٹ ٹرانسکرپشن ریگولیشن کے لیے لازمی ہے، جو mRNA کی برآمد، استحکام اور ترجمہ کو متاثر کرتی ہے۔ ان وٹرو ٹرانسکرپٹ (IVT) mRNAs کی صورت میں، پولی (A) دم کو یا تو کو-ٹرانسکرپشن کے دوران ایک ٹیمپلیٹڈ انداز میں متعارف کرایا جاتا ہے یا غیر ٹیمپلیٹڈ انداز میں انزیمیٹک ٹیلنگ کے عمل کے ذریعے۔ یہ 3′ پولی(A) IVT RNAs کے لیے ایک اہم کوالٹی انتساب (CQA) کے طور پر کام کرتا ہے، جس سے عمل کی نشوونما اور بیچ ریلیز دونوں کے دوران مکمل خصوصیات کی ضرورت ہوتی ہے۔
Yaohai Bio-Pharma خصوصی 3' پولی(A) کیریکٹرائزیشن خدمات فراہم کرتا ہے، جس میں تکنیکوں کو استعمال کیا جاتا ہے جیسے کہ رائبونیوکلیز T1 (RNase T1) کلیویج، آئن پیئر ریورسڈ فیز ہائی پرفارمنس مائع کرومیٹوگرافی (IP-RP-HPLC)/مائع کرومیٹوگرافی-ماس سپیکٹرومیٹری۔ (LC-MS)، اور جامع ڈیٹا تجزیہ۔
mRNA 3' poly(A) کی خصوصیت کے لیے ریگولیٹری تقاضے
ڈبلیو ایچ او کے ریگولیٹری تحفظات کے مطابق، "ایم آر این اے کی ساخت کی سالمیت کو ایم آر این اے کی رہائی کے لیے ایک اہم معیار کا وصف سمجھا جاتا ہے۔ اس طرح، mRNA کی سالمیت، 5′ کیپنگ کی کارکردگی، 3′ پولی (A) دم کی موجودگی یا لمبائی وغیرہ کے لیے کنٹرول کی ضرورت ہے۔
تجزیاتی طریقہ
تجزیہ |
طریقے |
mRNA 3' پولی (A) کی خصوصیت |
Lعمل انہضام کے بعد C-MS |
ضابطے
مرحلہ 1. RNase T1 کلیویج
LC-MS کی طرف سے مکمل لمبائی برقرار mRNA کا براہ راست تجزیہ اس کی جسامت اور متفاوت ہونے کی وجہ سے ناقابل عمل ہے۔ پولی (A) دم کی جانچ کرنے کے لیے، اسے پوری لمبائی کے mRNA سے کلیو کیا جانا چاہیے۔ مروجہ طریقہ میں RNase T1 کے ساتھ انزیمیٹک ہاضمہ شامل ہے، پولی(A) ترتیب کو محفوظ رکھتے ہوئے rG کے 3′ سرے کو منتخب طور پر صاف کرنا۔ mRNA نمونہ RNase T1 کے ساتھ عمل انہضام سے گزرتا ہے، اور پولی(A) اسٹریچ پر مشتمل کلیویج کے ٹکڑے oligo dT-coated مقناطیسی موتیوں کے استعمال سے الگ کیے جاتے ہیں۔
مرحلہ 2۔ IP-RP-HPLC/LC-MS
نکالی گئی دموں کا تجزیہ LC-MS کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا، جس میں سنگل نیوکلیوٹائڈ ریزولوشن پر دم کی لمبائی کی درست معلومات پیش کی گئیں۔ oligonucleotide LC-MS تجزیہ میں، amine موبائل فیز additives کے ساتھ آئن پیئرنگ ریورسڈ فیز (IP-RP) کی علیحدگی ترجیحی کرومیٹوگرافک موڈ کے طور پر کھڑی ہے، ان کی مضبوط حل کرنے کی طاقت اور ماس اسپیکٹومیٹری (MS) کے ساتھ مطابقت کی وجہ سے۔
مرحلہ 3۔ ڈیٹا کا تجزیہ
پولی (A) دم کی لمبائی اور اس کی نسبتا کثرت چوٹیوں کی تعداد اور شدت پر منحصر ہے جو اڈینوسین کے بڑے پیمانے پر تقسیم ہوتی ہے۔ ماس سپیکٹرم کو پروسیسنگ یا ڈی کنولوٹ کرنے پر، 100-میر پولی (A) ٹیل (باکس میں 33,163 Da) کا متوقع ماس معلوم ہوتا ہے، اس کے ساتھ 329 amu کے فاصلہ والے ماسز کا ایک سلسلہ ہوتا ہے، جو کہ اڈینوسین (A) کے بڑے پیمانے پر ہوتا ہے۔ .
LC-MS کے ساتھ 3' پولی(A) کی خصوصیت کا کیس
Yaohai-BioPharma نے mRNA 3' poly(A) کی خصوصیت کے لیے ایک مضبوط طریقہ تیار کیا ہے، جس میں RNase T1 کلیویج اور IP-RP-HPLC/LC-MS شامل ہیں۔
Yaohai-BioPharma نے mRNA 3' poly(A) کی خصوصیت کے لیے ایک مضبوط طریقہ تیار کیا ہے، جس میں RNase T1 کلیویج اور IP-RP-HPLC/LC-MS شامل ہیں۔
EN
