mRNA 5'کیپنگ کی کارکردگی
mRNA 5'capping Efficiency Analysis کی اہمیت
ایم آر این اے کے 5′ سرے پر واقع ٹوپی کا ڈھانچہ یوکرائٹس کے اندر ایم آر این اے کے موثر ترجمہ، استحکام اور نقل و حمل میں اہم کردار ادا کرتا ہے۔ ان وٹرو ٹرانسکرائبڈ (IVT) mRNA کے تناظر میں، 5' کیپ کو یا تو شریک ٹرانسکرپشن کیپنگ یا انزیمیٹک کیپنگ کے عمل کے ذریعے متعارف کرایا جاتا ہے۔ IVT RNAs کے ایک ناگزیر جزو کے طور پر، 5′ کیپ ایک اہم کوالٹی انتساب (CQA) کے طور پر کھڑا ہے جس کے لیے پورے عمل کی ترقی اور بیچ کی رہائی کے لیے جامع خصوصیات کی ضرورت ہوتی ہے۔
Yaohai-Bio Pharma جامع 5' کیپنگ کارکردگی کے تجزیہ کے حل فراہم کرتا ہے، جس میں oligonucleotide splints (probe) ڈیزائن، RNase H کلیویج، IP-RP- Ion-pair ریورسڈ فیز ہائی پرفارمنس مائع کرومیٹوگرافی (IP-RP-HPLCchromatography) ماس سپیکٹرو میٹری (LC-MS)، ڈیٹا کا تجزیہ۔
mRNA سالمیت کے لیے ریگولیٹری تقاضے
ڈبلیو ایچ او کے ریگولیٹری تحفظات کے مطابق، "ایم آر این اے کی ساخت کی سالمیت کو ایم آر این اے کی رہائی کے لیے ایک اہم معیار کا وصف سمجھا جاتا ہے۔ اس طرح، mRNA کی سالمیت، 5′ کیپنگ کی کارکردگی، 3′ پولی (A) دم کی موجودگی یا لمبائی وغیرہ کے لیے کنٹرول کی ضرورت ہے۔
تجزیاتی طریقہ
تجزیہ |
طریقے |
mRNA 5'کیپنگ کی کارکردگی |
Lعمل انہضام کے بعد C-MS |
ضابطے
مرحلہ 1. Oligonucleotide splints (probe) ڈیزائن
کلیویج پروب، جس میں 2'-O-methylnucleotides اور tetradeoxyribonucleotides شامل ہیں، RNase H موجود ہونے پر مخصوص جگہوں پر ایک تکمیلی RNA اسٹرینڈ کو صاف کرنے کا کام کرتا ہے۔ یہ طریقہ بڑے آر این اے کے ٹکڑوں کی ہدف شدہ نسل کے لیے انتہائی قیمتی ثابت ہوتا ہے۔
مرحلہ 2. RNase H درار
ایک بایوٹینیلیٹڈ پروب، جو سٹریٹجک طور پر mRNA کے 5' سرے کی تکمیل کے لیے ڈیزائن کیا گیا ہے، RNase H کے ساتھ مل کر 5' اختتامی اولیگونیوکلیوٹائڈ کے ہدف شدہ کلیویج کو کیٹلیز کرنے کے لیے لاگو کیا جاتا ہے جس میں ٹوپی کی ساخت ہوتی ہے۔
مرحلہ 3۔ IP-RP-HPLC/LC-MS
oligonucleotide LC-MS تجزیہ میں، ترجیحی کرومیٹوگرافک موڈ آئن پیئرنگ ریورسڈ فیز (IP-RP) علیحدگی ہے جو امائن موبائل فیز ایڈیٹوز کا استعمال کرتا ہے۔ اس کی وجہ ان کی اعلیٰ حل کرنے کی طاقت اور ماس اسپیکٹومیٹری (MS) کے ساتھ مطابقت ہے۔
مرحلہ 4۔ ڈیٹا کا تجزیہ
ڈیفاسفیٹ، ٹرائی فاسفیٹ، یا غیر میتھائلیٹڈ G کیپ (GpppG) کے برعکس، m7GpppG کیپ کی خاصیت والے کلیویج کے ٹکڑوں میں مشاہدہ کیا گیا الگ ماس، ان کی شناخت کو آسان بناتا ہے اور کیپنگ کی کارکردگی کا اندازہ لگاتا ہے۔
LC-MS کے ساتھ کیپنگ کی کارکردگی کے تجزیہ کا معاملہ
Yaohai-Bio Pharma نے oligonucleotide splints (probe) ڈیزائن، RNase H کلیویج، IP-RP-HPLC/LC-MS سے لے کر ڈیٹا کے تجزیہ تک، mRNA کیپنگ کارکردگی کے تجزیہ کے لیے مضبوط طریقے تیار کیے ہیں۔
کل آئن کرومیٹوگرامس (بائیں) اور الیکٹرو سپرے ماس سپیکٹرا (دائیں) 5' اینڈ کلیویج ٹکڑوں کا
EN
