آر این اے پیشگیوں کے بیچ کی تیاری کے بارے میں، عام طور پر استعمال ہونے والا طریقہ ان وٹرو ٹرانسکرپشن (IVT) ہے۔ IVT ردعمل لکیری پلاسمڈ DNA کا استعمال کرتا ہے جس میں T7 پروموٹر ہوتا ہے اور T7 RNA پولیمریز کی موجودگی میں سبسٹریٹ کے طور پر نیوکلیوسائیڈ ٹرائی فاسفیٹس (NTPs) کے ساتھ RNA پیشگی ترکیب کرتا ہے۔
وٹرو سائیکلائزیشن کے طریقوں میں کیمیکل ligation، enzymatic ligation اور permuted intron-exon (PIE) طریقہ شامل ہے۔ کیمیکل ligation اور enzymatic ligation چھوٹے RNAs کے چکر لگانے کے لیے موزوں ہیں۔ جب ٹکڑا 100 nt سے بڑا ہوتا ہے، تو سائیکلائزیشن کی شرح بہت کم ہو جائے گی۔ اس کے برعکس، PIE سسٹم پر مبنی نیوکلیز طریقہ 8 kb کی ترتیب کی سائیکلائزیشن حاصل کر سکتا ہے۔
guanosine triphosphate (GTP) کے کیٹالیسس کے تحت، PIE ڈھانچہ ایکسٹرا انٹرن سیکوینس کی سائیکلائزیشن سے گزرتا ہے۔ سائیکلائزیشن کی شرح کو بڑھانے کے لیے ایک معقول حکمت عملی کے ساتھ مل کر، Yaohai Bio-Farma 4% سے زیادہ کی سائیکلائزیشن کی کارکردگی کے ساتھ، 80 kb تک کی سائیکلائزیشن حاصل کر سکتا ہے۔
آر این اے کا ان وٹرو سائیکلائزیشن رد عمل اس طرح بہتا ہے:
RNA کا پیش خیمہ وٹرو ٹرانسکرپشن کے ذریعے ترکیب کیا جاتا ہے، اور PIE جزو GTP کے کیٹالیسس کے تحت سرک آر این اے بنانے کے لیے خود کو الگ کرتا ہے۔
عمل | سروس کی تفصیلات | ترسیل کی مدت (کام کے دن) |
وٹرو ٹرانسکرپشن اور گردش میں | ری ایکشن سسٹم کی تصدیق | 1-2 |
وٹرو ٹرانسکرپشن اور سائیکلائزیشن کے رد عمل میں | ||
RNase R ہاضمہ | ||
رد عمل کی اصلاح | رد عمل کی ساخت، وقت کی اصلاح | 2-5 |
RNA سائیکلائزیشن کے 4 kb تک حاصل کیا جا سکتا ہے.
80% سے زیادہ کی سائیکلائزیشن کی شرح عقلی ترتیب کی اصلاح کی حکمت عملی کے ذریعے حاصل کی جا سکتی ہے۔
تجرباتی ماحول اور استعمال کی اشیاء میں RNases کے سخت کنٹرول کے ذریعے RNA کے انحطاط کو مؤثر طریقے سے روکا جاتا ہے۔
ان وٹرو سائیکلائزیشن اور سرک آر این اے کی افزودگی
PIE سسٹم کی بنیاد پر، Yaohai Bio-Farma نے circRNA کی ترتیب کو بہتر بنایا ہے، جس میں ایگرز جیل الیکٹروفورسس (AGE) کے ذریعے سائیکلائزیشن کی شرح 80% سے زیادہ ہے۔ RNase R کا استعمال کرتے ہوئے circRNA کو تقویت بخشنے کے لیے، E-gel الیکٹروفورسس کے نتائج ظاہر کرتے ہیں کہ لکیری RNA کا پیش خیمہ ہضم ہو گیا ہے، اور مزید صاف کرنے کے بعد، زیادہ تر نکیڈ سرک آر این اے کو ہٹایا جا سکتا ہے۔ صاف کرنے کا حل Yaohai Bio-Farma نے خود تیار کیا ہے۔
ان وٹرو گردش اور سرک آر این اے کی افزودگی