Yaohai Bio-Pharma PIE سسٹم (ایکسونز اور انٹرن کی سیدھ) کی بنیاد پر circRNA تیار کرتا ہے، جو RNA سائیکلائزیشن کو حاصل کرنے کے لیے ٹائپ I انٹرنز کے خود کو الگ کرنے والے فنکشن پر انحصار کرتا ہے۔ PIE ڈھانچہ T4 td جین یا مچھلی والے tRNA پیشگی جین کا استعمال کرتے ہوئے ڈیزائن کیا گیا ہے، اور ترتیب اس طرح ہے:
آر این اے انٹرن اور سپورٹنگ ایگزون فریگمنٹ کو دو حصوں (5' ٹرمینل اور 3' ٹرمینل) میں تقسیم کیا گیا ہے، جہاں 5' ٹرمینل سیکوینس کو ہدف کی ترتیب کی دم میں منتقل کیا جاتا ہے، 3' ٹرمینل سیکوینس کو سامنے والے حصے میں داخل کیا جاتا ہے۔ ہدف کی ترتیب، اور ہدف جین کی ترتیب درمیان میں ڈالی جاتی ہے۔
جی ٹی پی کے کیٹالیسس کے تحت، پی آئی ای کا ڈھانچہ انٹرن کے علاوہ دیگر ترتیبوں کی سائیکلائزیشن کا باعث بنتا ہے۔ سائیکلائزیشن کی شرح کو بڑھانے کی معقول حکمت عملی کے ساتھ مل کر، Yaohai Bio-Farma 4% سے زیادہ کی سائیکلائزیشن کی شرح کے ساتھ 80 kb تک کی ترتیب کی سائیکلائزیشن حاصل کر سکتی ہے۔
شکل 1. PIE سسٹم پر مبنی سرک آر این اے کی ان وٹرو گردش
عمل | اختیاری سروس | سروس کی تفصیلات | ترسیل کی مدت (کام کے دن) |
circRNA ترتیب ڈیزائن اور اصلاح | کوڈنگ کی ترتیب کا ڈیزائن اور اصلاح |
سی ڈی ایس کی ترتیب کی سیدھ سی ڈی ایس کوڈن آپٹیمائزیشن |
1 |
نان کوڈنگ کے سلسلے کا ڈیزائن اور اصلاح |
انٹرن اور ایکسون ترتیب ڈیزائن اور اصلاح ہم جنس بازو ترتیب ڈیزائن اور اصلاح اسپیسر ترتیب ڈیزائن اور اصلاح |
1-2 |
سرک آر این اے اجزاء | حیاتیاتی افعال | اصلاح کی حکمت عملی | |
دو ٹرمینل انٹرن اور ایکسون کی ترتیب | انٹرن کے باہر کی ترتیبوں کی سائیکلائزیشن کے لیے جی ٹی پی کیٹیلائزڈ انٹرن سیلف سپلائزنگ۔ | T4 td جین یا مچھلی کے تیل کے tRNA پیشگی جین کے مطابق ڈیزائن کیا گیا ہے۔ | |
کوڈنگ | IRES | اندرونی رائبوزوم ریکگنیشن سائٹ جو circRNA کے ترجمہ کو منظم کرتی ہے۔ | مختلف وائرل ذرائع، جیسے EMCV، CVB3 ذرائع سے اندرونی رائبوزوم انٹری سائٹ (IRES) کی ترتیب کی اسکریننگ۔ |
CDS | پروٹین کوڈنگ والے علاقے، اینٹیجنز، اینٹی باڈیز یا دیگر فعال پروٹینز کے لیے ترتیب کوڈنگ۔ | کوڈن کی اصلاح ترجمہ کی سطح کو بڑھاتی ہے۔ بعض غیر بہترین کوڈنز پروٹین فولڈنگ میں کردار ادا کر سکتے ہیں۔ | |
نان کوڈنگ | غیر کوڈنگ کے سلسلے | جین یا پروٹین کے ضابطے کے لیے miRNAs یا پروٹین کو نشانہ بنائیں۔ | miRNAs یا پروٹین کے لیے مخصوص بائنڈنگ سائٹس کو نشانہ بنانا بائنڈنگ سائٹ کی ترتیب کو دہرا سکتا ہے۔ |
Yaohai Bio-Pharma نے کنٹرول پروڈکٹ اینہنسڈ گرین فلوروسینٹ پروٹین (eGFP) circRNA لانچ کیا، جو RNA کی سائیکلائزیشن کو حاصل کرنے کے لیے PIE سسٹم پر مبنی ہے۔
ایک روایتی ٹرانسفیکشن ری ایجنٹ کا استعمال کرتے ہوئے، eGFP circRNA کو 293T خلیوں میں تبدیل کیا جاتا ہے، اور eGFP (سبز) فلوروسینٹ سگنل کا پتہ 24 گھنٹے کے بعد لگایا جا سکتا ہے، جس میں 48 گھنٹے کے بعد اضافہ کیا جائے گا۔ فلوروسینٹ سگنل کو 7 ویں دن اور 14 ویں دن کے بعد بھی پتہ لگایا جا سکتا ہے۔ منتقلی
ای جی ایف پی سرک این اے کی وٹرو اظہار کی توثیق