Priprema IVT mRNA

Transkripcija in vitro (IVT) je poželjna metoda za pripremu mRNA, sposobna da daje mikrograma do miligrami mRNA na laboratorijskoj razini. Za istraživačke svrhe, dobavljači reagenskih sredstava su razvili fleksibilne sisteme IVT reakcije koji su pogodni za mRNA umjerene dužine (1000-4000 nukleotida).

U ovom članku ćemo sažeti transkripciju in vitro (IVT) mRNA, uključujući konvencionalni sistem IVT reakcije koji se koristi na laboratorijskoj razini i sistem IVT reakcije koji je pogodan za ultra-duge mRNA (>9000 nukleotida).

Sadržaji omogućavaju ko-transkripcijsko zakupljanje sa CleanCap AG i smanjenje imunogenosti uzorka pomoću m1ψ. DNase I uklanja ostatnike DNA. Niska dobijenost može biti posledica lošeg mešanja, oksidacije reagensa ili problema sa DNA šablonom, što se može smanjiti centrifugiranjem, koristeći sveže reagente, kontrole i prilagođavanjem količine šablona/vremena reakcije.

Yaohai Bio-Pharma nudi različite prethodno pripremljene IVT RNA proizvode (tekuća/freeze-dried prah) i LNP gotove proizvode, koji kodiraju proteine kao što su fluorescentski proteini (eGFP, mCHERRY), luciferaza, rekombinaza Cre i antigen OVA, kako bi se ispunile različite eksperimentalne ili projektna potrebe.

IVT Sistem za Ultra-duge mRNA

Konvencionalni IVT možda neće raditi za prekomerno duge mRNA (>9000 nt). Potrebno je dublje razumevanje i racionalna prilagođavanja komponenti IVT-a.

DNA Šablon: Linearizovani plazmidi ili PCR proizvodi sa odgovarajućim sekvencama promotor, raspredjeni u RNase-slobodnoj H2O. Preporučljiva koncentracija DNA šablona je veća od 40 nM za optimalne uslove IVT-a.

DTT: Održava enzimsku aktivnost tijekom transkripcije. Treba dodati čisti DTT u reakcijski bufer za optimalnu enzimsku aktivnost.

RNase Inhibitor: Inhibira RNase aktivnost i održava stabilnost mRNA-a.

T7 RNA Polimeraza: Katalizuje transkripciju DNA u RNA, odgovarajući sekvenci promotor. Aktivnost T7 RNA polimeraze utiče pH i magnezijumski ioni.

Magnezijumski ioni (Mg2+): Kofaktor za RNA polimerazu. Preniske koncentracije smanjuju efikasnost transkripcije, dok previsoke koncentracije vode do degradacije RNA. Slobodan [Mg2+] treba da se prilagodi na osnovu koncentracije nukleotida. Svaki nukleotid vezuje jedan [Mg2+], pa je potrebno da se koncentracija [Mg2+] nadigne iznad ukupne koncentracije nukleotida.

Nukleozid trifosfati (NTP): Kao substracti, NTP-ovi su osnovne jedinice RNA. Koncentracije NTP-ova iznad 7 mM imaju pozitivan uticaj na proizvodnju mRNA.

Spermidin: Stabilizuje komplekse DNA-enzima i stimulise reakcije transkripcije; međutim, previsoke koncentracije imaju inhibicioni efekat. Preporučena koncentracija spermidina je između 1 i 3 mM.

Inorganicki pirofosfatase (PPase): Dodato u IVT reakcije kako bi se sprečilo nagomilavanje jonova neorganiskog pirofosfata (PPi), izbjegavajući njihovu helačiju sa Mg2+ i osiguravajući dovoljno slobodnog Mg2+.

Koristeći inovativnu tehnologiju i iskustvo u oblasti IVT mRNA, Yaohai Bio-Pharma pruža uslugu punog ciklusa za IVT RNA, uključujući dizajn nizova, pripremu IVT RNA (sa m1ψ modifikacijama), ciklizaciju RNA, čišćenje, zasusavanje, enkapsulaciju LNP-iem i testiranje kvaliteta.

Takođe aktivno tražimo globalne parcele, institucionalne ili individuelne. Ponudili smo najbolju kompenzaciju u industrijи. Ako imate bilo kakva pitanja, slobodno nas kontaktirajte: [email protected]